Antivirale Aktivität natürlicher Phenolverbindungen im Komplex an einer allosterischen Stelle von SARS

Jun 13, 2023

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 805 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Papain-ähnliche Protease (PLpro) von SARS-CoV-2 deckt mehrere Funktionen ab. Neben der Cystein-Protease-Aktivität, die die Spaltung der viralen Polypeptidkette erleichtert, hat PLpro die zusätzliche und wichtige Funktion, Ubiquitin und ISG15 (Interferon-stimuliertes Gen 15) aus Wirtszellproteinen zu entfernen, um Coronaviren dabei zu unterstützen, den angeborenen Immunantworten des Wirts zu entgehen. Wir haben drei an PLpro gebundene phenolische Verbindungen identifiziert, die durch das Screening einer Bibliothek natürlicher Verbindungen wesentliche molekulare Wechselwirkungen mit ISG15 verhindern. Die durch Röntgenscreening identifizierten und mit PLpro komplexierten Verbindungen zeigen in einem DeISGylierungsaktivitätstest eine deutliche Hemmung von PLpro. Zwei Verbindungen zeigen in Vero-Zelllinien-Assays eine ausgeprägte antivirale Aktivität und eine inhibierte eine zytopathische Wirkung in nicht zytotoxischen Konzentrationsbereichen. Im Zusammenhang mit zunehmenden PLpro-Mutationen in den sich entwickelnden neuen Varianten von SARS-CoV-2 könnten die von uns identifizierten natürlichen Verbindungen auch die antiviralen Immunantwortprozesse des Wirts wiederherstellen, die bei COVID-19-Infektionen herunterreguliert sind.

Die durch SARS-CoV-2 verursachte Coronavirus-Krankheit COVID-19 ist weiterhin verheerend mit hohen Infektions- und Todeszahlen1. In nur einem Jahr wurden weltweit mehrere zugelassene und hochwirksame Impfstoffe gegen COVID-19 entwickelt. Allerdings sind diese Impfstoffe nicht überall auf der Welt einheitlich verfügbar, sodass bereits neue SARS-CoV-2-Varianten aufgetaucht sind, die sich in Zukunft auf die Wirksamkeit der verfügbaren Impfstoffe auswirken könnten2. Parallel dazu sind weitere Anstrengungen erforderlich, um alternative Behandlungen für mit SARS-CoV-2 infizierte Patienten zu identifizieren und zu optimieren, die auf Impfstoffe nicht ansprechen oder diese nicht vertragen3. Daher wird zügig geforscht, um durch die Anwendung komplementärer Strategien wirksame Medikamentenkandidaten zu identifizieren. Ein Ansatz, den wir kürzlich verfolgt haben, ist das umfangreiche röntgenkristallographische Screening nach Inhibitoren der SARS-CoV-2-Hauptprotease Mpro, einem essentiellen Protein im viralen Replikationsprozess und daher ein wichtiges Medikamentenziel4. Wir haben sechs Mpro-hemmende Verbindungen identifiziert, die eine antivirale Aktivität zeigten, und diese Verbindungen nähern sich derzeit dem Schritt präklinischer Untersuchungen4.

Das einzelsträngige RNA-Genom mit positivem Sinn von Coronaviren kodiert für 16 nichtstrukturelle Polyproteine ​​(nsps 1–16). Die Papain-ähnliche Protease (PLpro) ist eine Domäne, die Teil des nsp3-Gens ist, dem größten reifen SARS-CoV-2-Protein5. PLpro ist erforderlich, um das Motiv LXGG in vorverarbeiteten Polyproteinen zwischen nsp1/2, nsp2/3 und nsp3/4 zu erkennen und in funktionelle Einheiten zur Initiierung, Replikation und Transkription des viralen Genoms zu spalten6,7. Neben der proteolytischen Aktivität kann PLpro auch Ubiquitinketten oder ISG15 (Interferon-stimuliertes Genprodukt 15) aus ubiquitinierten oder ISGylierten Proteinen binden und spalten8. Die Deubiquitinase (DUB) sowie deISGylierende Aktivitäten sind für die Coronaviren von entscheidender Bedeutung, um die Immunantworten des Wirts zu antagonisieren. Es wurde gezeigt, dass die Monoubiquitinierung an den Membranen des endoplasmatischen Retikulums (ER) die Endozytose und den Vesikeltransport reguliert und daher für die Ausbreitung des Coronavirus wichtig ist9. Andererseits führt ISG15 zu Veränderungen des Stoffwechselwegs, die zu übermäßigen Entzündungs- und Autoimmunreaktionen aufgrund von Fehlregulationen des Interferonsystems führen10,11. Zielproteine ​​für das Coronavirus, wie z. B. IRF3 (Interferon-Regulationsfaktor 3), müssen mit ISG15 konjugiert werden, um für ihren Eintritt in den Zellkern korrekt phosphoryliert zu werden, wo sie für nachgeschaltete Signalereignisse benötigt werden, z. B. über den IFN-β-Weg12, um ein antivirales Mittel auszulösen Immunreaktion. Daher macht die Cysteinproteaseaktivität zusammen mit der Deubiquitinase- und deISGylierungsaktivität von PLpro dieses Enzym zweifellos zu einem vielversprechenden Ziel für Untersuchungen zur Arzneimittelentwicklung13,14. Darüber hinaus wurde die Bedeutung von PLpro als Wirkstoffziel in mehreren neueren Studien13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 hervorgehoben, in denen neue und unerwartete Mutationen in der PLpro-Domäne des nsp3-Gens identifiziert wurden die besorgniserregenden SARS-CoV-2-Varianten (VOC), die derzeit in verschiedenen Teilen der Welt zirkulieren23,24.

Die Kristallstruktur von SARS-CoV PLpro im Komplex mit Lys48-gebundenem Diubiquitin25 (PDB-Code 5E6J) lässt eindeutig auf einen Mechanismus der DUB-Wirkung schließen, bei dem die LXGG-Reste am C-Terminus des Ubiquitinmoleküls in einer Spalte binden ( Die proximale Bindungsstelle von Ub S1 befindet sich in der Nähe des katalytisch aktiven Zentrums und ermöglicht so eine effiziente Spaltung. Darüber hinaus zeigt die kürzlich erhaltene Kristallstruktur von SARS-CoV-2 PLpro im Komplex mit Maus-ISG1526, dass die N-terminale Region von ISG15 mit PLpro an einer Bindungsstelle interagiert, die als distale ISG15/Ub S2-Bindungsstelle bezeichnet wird. Im Vergleich zur Kristallstruktur von ISG15 (PDB-Code 5TLA) ist der N-terminale Teil des ISG15-Moleküls in der komplexen Struktur von SARS-CoV-2 PLpro um etwa 90° gedreht und koordiniert mit der S2-Helix. Diese unterschiedlichen Bindungsereignisse erklären und verdeutlichen, warum SARS-CoV-2 PLpro und SARS-CoV-PLpro trotz einer gemeinsamen Sequenzidentität von 83 % unterschiedliche Substratpräferenzen aufweisen. Kürzlich wurden Daten veröffentlicht, die eine höhere Affinität und Spezifität von SARS-CoV-2 PLpro zu ISG15 zeigen, wohingegen SARS-CoV-PLpro bevorzugt Ubiquitinketten spaltet, was mit der wesentlich höheren Morbidität und Mortalität von SARS-CoV-2 im Vergleich zu SARS verbunden sein könnte -CoV-Infektionen27.

Bisher wurden mehrere Hochdurchsatz-Assay-Screening-Aktivitäten (HTS) initiiert, die sich auf die Identifizierung potenzieller Inhibitoren von PLpro mithilfe der Umnutzung von Verbindungsbibliotheken konzentrieren. Leider gelang es ihnen nicht, Verbindungen zu finden, die weiterentwickelt werden könnten, um ein wirksames antivirales Medikament zu erhalten27. Daher haben wir eine andere Strategie entwickelt, um eine einzigartige Bibliothek bestehend aus 500 natürlichen Verbindungen zu erforschen, die von der Molecular Bank, ICCBS, Karachi, Pakistan, durch strukturbasiertes Arzneimitteldesign zusammengestellt und charakterisiert wurde (https://iccs.edu/page-mol -Bank). Aus Pflanzen gewonnene natürliche Verbindungen der ICCBS Molecular Bank weisen Eigenschaften wie eine hohe chemische Vielfalt, medizinisch relevante Antitumor-, Antioxidations-, entzündungshemmende und vor allem antivirale Wirkung mit typischerweise milderen oder keinen Nebenwirkungen sowie geringere Produktionskosten auf im Vergleich zu den meisten auf dem Markt erhältlichen Medikamenten28. Einige dieser Verbindungen werden seit langem auch als Arzneimittelmoleküle zur Behandlung verschiedener menschlicher Krankheiten eingesetzt, darunter Virusinfektionen wie die Hepatitis-C-Virusinfektion29. Aktuelle Berichte belegen auch den potenziellen Einsatz pflanzlicher Moleküle und ihrer Sekundärmetaboliten gegen SARS-CoV-2 und andere menschliche Coronaviren30,31,32 durch die Anwendung von In-vitro- und In-silico-Ansätzen. Allerdings war unseres Wissens bisher kein systematisches Screening von Naturstoffen durch strukturbasierte Wirkstoffforschung verfügbar, das direkte experimentelle Daten zur Komplexbildung liefern würde.

Unser Hochdurchsatz-Screening mittels Röntgenkristallographie identifizierte drei natürliche Verbindungen, die an PLpro gebunden sind. Alle drei Verbindungen, 4-(2-Hydroxyethyl)phenol (YRL), 4-Hydroxybenzaldehyd (HBA) und Methyl-3,4-dihydroxybenzoat (HE9), sind Phenolderivate, die als Polyphenole klassifiziert werden, eine wichtige und Hauptklasse vorhandener bioaktiver Verbindungen in Pflanzen. Diese große Gruppe bioaktiver Verbindungen ist in fünf Hauptklassen unterteilt: Hydroxybenzoesäuren, Hydroxyzimtsäuren, Flavonoide, Stilbene und Lignane. Zusätzlich zu den bekannten antioxidativen und entzündungshemmenden Aktivitäten von Phenolderivaten wurde in mehreren Studien über ihr antivirales Potenzial gegen das Epstein-Barr-Virus33,34, das Enterovirus 7135, das Herpes-simplex-Virus (HSV)36 und das Influenzavirus37 berichtet. und andere Viren, die Atemwegsinfektionen verursachen38.

Interessanterweise binden alle drei Verbindungen YRL, HBA und HE9 an der gleichen und noch unerforschten allosterischen ISG15/Ub-S2-Bindungsstelle in der Daumenregion von PLpro, indem sie spezifische Wechselwirkungen bilden und PLpro in DeISGylierungsaktivitätstests deutlich hemmen. Keine dieser Leitverbindungen ist in zellulären Zytotoxizitätstests zytotoxisch und könnte daher vielversprechende Leitverbindungen mit dem Potenzial sein, als spezifische koronavirale PLpro-Inhibitoren entwickelt zu werden. Bezeichnenderweise zeigen zwei von ihnen eine antivirale Aktivität und einer hemmt in zellulären Tests zytopathische Wirkungen im Bereich von 60–80 % in einem nicht-zytotoxischen Konzentrationsbereich von bis zu 100 µM. Diese drei natürlichen Phenolverbindungen bilden zweifellos ein Gerüst als antivirale Medikamente für die weitere Entwicklung und Optimierung zur Verhinderung und/oder Reduzierung der SARS-CoV-2-Virusreplikation und zur gleichzeitigen Wiederherstellung und Unterstützung der angeborenen Immunantwort des Wirts.

Wir haben einen strukturbasierten Wirkstoffentdeckungsansatz initiiert, um potenzielle Inhibitoren für PLpro durch Röntgenscreening von 500 Verbindungen der ICCBS Molecular Bank zu identifizieren. SARS-CoV-2 PLpro wurde rekombinant in Escherichia coli exprimiert und als Monomer bis zur Homogenität gereinigt (siehe Methoden). Wildtyp-Enzymkristalle wurden in einem stabilen und reproduzierbaren Zustand erhalten und Röntgenstrahlen mit einer hohen Auflösung von 1,42 Å gebeugt. Die Datenerfassungs- und Verfeinerungsstatistiken sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die für das Wildtyp-Enzym erhaltenen Elektronendichtekarten ermöglichten die Aufklärung aller 315 Aminosäurereste, des Zinkions und 529 Lösungsmittelwassermoleküle. Darüber hinaus konnten ein Glycerinmolekül aus dem Kryoschutzmittel, das zum Einfrieren von Kristallen verwendet wird, sowie ein Phosphat- und zwei Chloridionen in der Elektronendichtekarte modelliert werden.

PLpro faltet sich mit einer rechtshändigen Architektur bestehend aus Daumen-, Handflächen- und Fingerdomänen mit einer katalytischen Triade bestehend aus Cys111-His272-Asp286 und einer N-terminalen Ubiquitin-ähnlichen Domäne (Abb. 1). Vier Cysteinseitenketten koordinieren ein Zinkion und bilden ein „Zinkfingermotiv“, das für die strukturelle Stabilität und Proteaseaktivität des Enzyms wesentlich ist39. Die Gesamtstruktur von SARS-CoV-2 PLpro ist homolog zu SARS-CoV PLpro (PDB-Code 2FE8), das eine Sequenzidentität von 83 % mit einem rmsd von 0,58 Å für 260 äquivalente Cα-Atome aufweist, und auch zu MERS-CoV PLpro (PDB). Code 4RNA) trotz einer geringeren Sequenzidentität von 29 % und einem entsprechenden RMSD von 1,83 Å für 258 äquivalente Cα-Atome (Abb. S4 und S8). Die strukturell dynamischsten Regionen sind die Ubiquitin-Falten- und die Zinkfinger-Domäne. Die Region des katalytisch aktiven Zentrums ist unter den verschiedenen koronaviralen PLpro-Enzymen konformativ gut konserviert. Der Zugang zum aktiven Zentrum wird über eine flexible Schleife namens „Blocking Loop 2“ (BL2, Abb. 1) reguliert, da diese Schleife im Zusammenhang mit der Substratbindung von einer „offenen“ in eine „geschlossene“ Konformation wechselt40. Eine Reihe bekannter PLpro-Inhibitoren binden an dieser Stelle, darunter der hochaffine Inhibitor GRL0617, und in dieser Schleife wurden strukturelle Variationen zwischen verschiedenen PLpro-Enzymen beobachtet41.

PLpro-Domänen werden in einer rechtshändigen Architektur dargestellt, Ubiquitin-Faltung (blau), Daumen (grün), Handfläche (lachsrosa) und Finger (hellorange). Die Reste des katalytischen aktiven Zentrums Cys 111, His 272 und Asp 286 werden als Stäbchen dargestellt und ein Zinkion in der Fingerdomäne wird als graue Kugel dargestellt. Die flexible Blockierungsschleife (BL2-Schleife), die im Zusammenhang mit der Substratbindung ihre Konformation ändert, ist blau dargestellt. YRL- (grüne Kugeln), HBA- (gelbe Kugeln) und HE9-Verbindungen (rosa Kugeln) binden an der allosterischen Stelle, die etwa 30 Å vom aktiven Zentrum entfernt liegt. Die an der Wechselwirkung des ISG15-Moleküls beteiligte S2-Helix ist angegeben. Der Einschub zeigt eine vergrößerte Ansicht der beiden Verbindungen HBA und YRL in der Bindungsstelle.

Kristalle von SARS-CoV-2 PLpro im Komplex mit den drei natürlichen Verbindungen wurden durch Cokristallisation unter Verwendung der Dampfdiffusionsmethode in einem Screening-Ansatz unter Verwendung von 500 Molekülen aus einer Bibliothek natürlicher Verbindungen erhalten. Kristalle wurden unter den gleichen Bedingungen wie für das native PLpro gezüchtet und Beugungsdatensätze im Auflösungsbereich von 1,7–1,9 Å gesammelt. Über 2000 Kristalle wurden geerntet und mehrere Datensätze für jede Verbindung gesammelt, was zu etwa 2500 Beugungsdatensätzen führte (Abb. S12). Mit Inhibitorverbindungen komplexierte PLpro-Strukturen wurden unter Verwendung des ligandenfreien PLpro (PDB-Code 7NFV) als Referenzmodell für die konsistente Indizierung von Datensätzen mit einer zuvor eingerichteten automatischen Pipeline4 gelöst (siehe Methoden). Die Datenerfassungs- und Verfeinerungsstatistiken sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die drei erhaltenen komplexen Strukturen überlagern sich gut mit der ligandenfreien Struktur 7NFV mit einem RMSD von 0,26 Å (298 Cα-Atome) zu 7OFS und einem RMSD von 0,07 Å (283 Cα-Atome) zu 7OFU und rmsd von 0,33 Å (299 Cα-Atome) bis 7OFT. Die drei Verbindungen binden an der allosterischen Stelle ISG15/Ub S2 in der Nähe der Daumenregion von PLpro (Abb. 1), die etwa 30 Å vom Rest des aktiven Zentrums Cys 111 entfernt liegt. Die Wechselwirkung zwischen diesen allosterischen Inhibitoren und PLpro erfolgt über Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe und π-Stapelwechselwirkungen (Abb. S5, S6 und S7).

Die aus Lawsonia alba isolierte natürliche Verbindung 4-(2-Hydroxyethyl)phenol (YRL) ist ein bekanntes Antioxidans und ein Mittel gegen Herzrhythmusstörungen (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/2). -_4-Hydroxyphenyl_ethanol). YRL bindet an PLpro an der allosterischen ISG15/Ub S2-Bindungsstelle in einem hydrophoben Hohlraum mit einer vorhergesagten Bindungsenergie von –7,17 kcal/mol (berechnet mit Prodigy42). Der Benzolkern ist durch hydrophobe Wechselwirkungen mit Seitenketten von Val 11, Val 57, Pro 59, Tyr 72 und Leu 80 bedeckt. Das Stickstoffatom der Hauptkette von Leu 80 ist über ein Wassermolekül über eine Wasserstoffbrücke an den Hydroxyethylsubstituenten von YRL gebunden . Interessanterweise wird der Hydroxyethylsubstituent mit zwei alternativen Konformationen beobachtet und so verfeinert, dass er in der komplexen Struktur die gleiche Besetzung aufweist. Eine Konformation bildet eine Wasserstoffbrücke zum Carbonylrückgrat von Asp 76, der alternativen Hydroxylgruppe zur Carbonylgruppe von Thr 74. Beide alternativen Hydroxylgruppen ersetzen Wassermoleküle im ligandenfreien Enzym und haben am Eingang der Bindungstasche Kontakte zu Lösungsmittelwassermolekülen . Das phenolische Hydroxyl wird am Boden der Bindungstasche über eine Wasserstoffbrücke an den Carbonylsauerstoff von Val 57 gebunden, um die Wechselwirkung des Liganden YRL in der PLpro-YRL-Komplexstruktur zu vervollständigen (Abb. S5).

Die zweite Verbindung, 4-Hydroxybenzaldehyd (HBA), isoliert aus Acalypha torta, ist ein bekanntes Antitumormittel43,44. Die berechnete Bindungsenergie für die Wechselwirkung des HBA-Liganden mit PLpro beträgt −6,97 kcal/mol. Der Benzolkern und das phenolische Hydroxyl werden an derselben Position beobachtet und weisen daher eine ähnliche Wechselwirkung mit PLpro auf, wie oben für YRL beschrieben (Abb. S6). Der Abstand der phenolischen Hydroxylgruppe beider Verbindungen zum Cα von Val 11 weist auf eine CH···O-Wasserstoffbrücke hin (3,4 Å). Der Aldehydsubstituent hat am Eingang der Bindungstasche schwache Wasserkontakte. Die bemerkenswerte Strukturänderung von PLpro zur Aufnahme dieser beiden Verbindungen besteht darin, dass die Seitenkette von Leu 80 in den komplexen PLpro-Strukturen wegkippen muss (Abb. S13).

Die dritte Verbindung, Methyl-3,4-dihydroxybenzoat (HE9), isoliert aus Tagetes patula (Ringelblume), ist ein wichtiges Diphenol, das in grünem Tee vorkommt und antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen hat45 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih). gov/compound/Methyl-3_4-dihydroxybenzoat). Die berechnete Bindungsenergie für diese Wechselwirkung beträgt −6,15 kcal/mol. HE9 bindet an der Oberfläche von PLpro neben dem Bindungshohlraum mit den Liganden HBA und YRL. Die Wechselwirkung mit PLpro wird durch Wasserstoffbrückenbindungen der Dihydroxyphenolkante zur Seitenkette von Glu 70 gebildet. Hydrophobe Wechselwirkungen werden beobachtet, einschließlich der π-Stapelung mit dem Imidazol von His 73 und Kontakten des Benzolkerns mit der Seitenkette von Phe69 (Abb . S7). Die Extraktion, Isolierung und Reinigung der drei Verbindungen HBA, YRL und HE9 werden in den ergänzenden Anmerkungen 1, 2 und 3 dargestellt. Die NMR-Spektren von HBA, YRL und HE9 sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. S1, S2 und S3.

Wir haben die Bindungskonstanten für die Liganden HBA und HE9 anhand ihrer Löschwirkung auf die Fluoreszenz für PLpro mithilfe der nanoDSF-Methode (Nano Differential Scanning Fluorimetry)46 bestimmt. Dies führte zu Kd-Werten von ~400 μM für HBA und 1 mM für HE9 (abhängig von der verwendeten Emissionswellenlänge, Abb. S15). YRL zeigte eine hohe intrinsische Fluoreszenzintensität und konnte daher nicht in einem Fluoreszenztitrationsexperiment verwendet werden. Da YRL strukturell sehr homolog zu HBA ist und in derselben Tasche von PLpro bindet, gehen wir von einer ähnlichen Bindungsaffinität aus.

Die beschriebenen Interaktionsnetzwerke der drei Verbindungen umfassen die Aminosäurereste Phe 69, Glu 70 und His 73, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie mit ISG15- und Lys48di-Ub-Molekülen interagieren25,26. Kristallstrukturen von SARS-CoV PLpro im Komplex mit Lys48di-Ub (5E6J) und SARS-CoV-2 PLpro im Komplex mit Maus-ISG15 (6YVA), unterstützt durch Molekulardynamiksimulationen, zeigen deutlich die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen diesen Aminosäureresten in PLpro mit entweder ISG15- oder Lys48-di-Ubiquitin-Molekülen26. Eine Überlagerung der PLpro+Inhibitor-Komplexstrukturen mit dem PLpro+ISG15-Komplex (Abb. 2a) zeigt, dass die Bindung der natürlichen Verbindungen die Bindung von ISG15 an PLpro deutlich stört und verhindert. Die kritischen Reste Ser 22, Met 23 und Glu 27 in der Bindungsoberfläche von ISG15 stehen nach der Bindung dieser Naturstoffe nicht mehr für die Bildung von Wechselwirkungen mit PLpro zur Verfügung (Abb. 2b).

a Überlagerung der Kristallstrukturen von SARS-CoV-2 PLpro-C111S im Komplex mit Maus-ISG15 (PDB-Code 6YVA, ISG15-Molekül in blau) mit SARS-CoV-2 PLpro+HE9 (PDB-Code 7OFU, in grauer Flächendarstellung) . Die drei Verbindungen YRL, HBA und HE9 sind als Kugeln dargestellt. b Nahaufnahme der ISG15-Bindungsstelle. Das ISG15-Molekül ist als Cartoon-Darstellung (blau) mit den interagierenden Resten Ser 22, Met 23 und Glu 27 in Stäbchen dargestellt. Die gebundenen Inhibitorverbindungen (Kugeln) verhindern eindeutig die Bindung des ISG15-Moleküls an die S2-Bindungsstelle von PLpro.

PLpro-Enzyme teilen sich den gleichen Kernrest, SARS-CoV Phe 70 und SARS-CoV-2 Phe 69, an der ISG15-Bindungsstelle. Eine Mutation dieses Rests in PLpro zu Alanin verringerte die enzymatische Aktivität und führte auch zu einer langsameren Reaktion mit ISG15 im Vergleich zum Wildtyp-Enzym26. In MERS-CoV PLpro ist Phe 69 durch einen Lysinrest (F69K) und His 73 durch einen Glycinrest (H73G) ersetzt. Diese Variationen könnten für die unterschiedlichen Substratpräferenzen zwischen SARS-CoV und SARS-CoV-2 und MERS PLpro verantwortlich sein. Aus einer Überlagerung der Kristallstruktur des MERS-CoV PLpro+ISG15 (6BI8) mit der SARS-CoV-2 PLpro-HE9-Komplexstruktur (7OFU) ist ersichtlich, dass F69K- und H73G-Substitutionen unterschiedliche Oberflächeneigenschaften verleihen Interaktion mit ISG15 (Abb. S10a, b).

Die Spaltung von Polyubiquitinketten durch SARS-CoV-2 PLpro wird deutlich verstärkt, wenn eine längere Ubiquitinkette verwendet wird. Dies zeigt, dass entweder Ub- oder ISG15-Moleküle nicht nur an die Ub-S1-Bindungsstelle, sondern auch an die Ub-S2-Bindungsstelle binden, was durch die konservierte S2-Helix in PLpro erleichtert wird und für die enzymatische Aktivität wichtig ist47. Die Überlagerung der Kristallstrukturen von PLpro im Komplex mit Lys48-gebundenem Diubiquitin (5E6J) mit dem PLpro-HE9-Komplex (7OFU) zeigte, dass die an der Ubiquitinierung beteiligten Schlüsselreste Lys 11 und Lys 48 in der S2-Ub-Bindungsstelle nicht mehr vorhanden sind verfügbar für die Bindung entweder an Ubiquitin oder ISG15 (Abb. S9 a, b). Daher ergibt sich aus den drei PLpro-Inhibitor-Komplexstrukturen eine klare molekulare Grundlage für die Hemmung, was zeigt, dass PLpro-ISG15-Wechselwirkungen von der Bindung der drei phenolischen Naturstoffe beeinflusst werden.

Es wurden Fluoreszenzaktivitätstests durchgeführt, um die Hemmwirkung der drei Verbindungen (HE9, YRL und HBA), die zusammen mit dem Wildtyp-SARS-CoV-2-PLpro kristallisierten, zu bewerten. Als Kontrolle wurde eine katalytisch inaktive PLpro-Mutante (C111S) verwendet, wobei ISG15-Rhodamin und Ub-Rhodamin als Substrate verwendet wurden. Wildtyp-PLpro (WT PLpro) stellt bei einer Konzentration von 10 nM 100 % der DeISGylierungsaktivität dar und die drei natürlichen Verbindungen YRL, HBA und HE9 zeigen bei 50 µM eine deutliche Hemmung der enzymatischen Aktivität von PLpro unter Verwendung von ISG15-Rhodamin als Substrat. Insbesondere die beiden Verbindungen HBA und YRL verringerten die PLpro-Aktivität signifikant um ca. 73 bzw. 70 %, gefolgt von einer Hemmung von HE9 auf ca. 55 % in einem DeISGylierungstest (Abb. S11); während die Hemmung bei Verwendung von Ub-Rhodamin als Substrat nicht so ausgeprägt war (Abb. S16). Es kann erklärt werden, dass die Bindung der natürlichen Verbindungen an die S2-Helixregion eindeutig die wesentlichen PLpro/ISG15-Molekülwechselwirkungen verhindert, die für den DeISGylierungsmechanismus von PLpro erforderlich sind.

Darüber hinaus haben wir die Wirksamkeit der Hemmung durch die Durchführung von In-vitro-IC50-Tests bestimmt, die eine wirksame Hemmung der drei Verbindungen HE9 (Methyl-3,4-dihydroxybenzoat), HBA (p-Hydroxybenzaldehyd) und YRL (4-(2-Hydroxyethyl)phenol) zeigten ), in einem Konzentrationsbereich von 3,76 ± 1,13, 3,99 ± 1,33 bzw. 6,68 ± 1,20 μM. Als Kontrolle wurde die Verbindung GRL0617 (5-Amino-2-methyl-N-[(1R)-1-(1-naphthalinyl)ethyl]benzamid), ein bekannter Inhibitor von PLpro, verwendet (Abb. 3a). Um die Spezifität der drei Verbindungen gegenüber PLpro zu charakterisieren, wurden auch enzymatische Hemmungstests mit der SARS-CoV-2-Hauptprotease (Mpro) und die Anwendung der drei Verbindungen durchgeführt, wobei das gleiche PLpro-Protokoll mit einer Inkubationszeit von bis zu 6 Stunden berücksichtigt wurde. Die Ergebnisse zeigten eindeutig keine hemmende Wirkung der Mpro-Aktivität in Gegenwart der drei natürlichen Verbindungen im Vergleich zum bekannten Mpro-Inhibitor GC-376, wie in Abb. S14 dargestellt. Über antivirale Aktivitäten dieser natürlichen Phenolverbindungen, entweder in roher oder gereinigter Form, wurde bereits berichtet35,38 und kann nun mit der PLpro-Hemmung in Zusammenhang gebracht werden, wie in unseren Aktivitätstests gezeigt. Allerdings können wir die Wechselwirkung dieser Verbindungen mit anderen lebenswichtigen zellulären Zielproteinen nicht ausschließen. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass die PLpro-Minimaldomäne nicht in der Lage ist, das Nsp1/2-Fusionsprotein zu spalten, und es wurde gezeigt, dass das Nsp3-Kernprotein voller Länge erforderlich ist, um die PLpro-Peptidaseaktivität darzustellen, was berücksichtigt werden muss Bedingungen für Arzneimittelforschungsuntersuchungen48.

Eine IC50-Bestimmung wurde mit ISG15-Rhodamin als Substrat bei einer Konzentration von 250 nM durchgeführt. Im Reaktionsgemisch wurde eine Gradientenkonzentration aller drei Verbindungen YRL, HBA, HE9 und des Inhibitors GRL-0617 als Kontrolle im Bereich von 2 bis 50 µM verwendet. Die IC50-Werte wurden durch Anpassen der Daten an eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Hemmungsfunktion berechnet und werden zur Interpolation in der logarithmischen Skala dargestellt. Einzelne Datenpunkte stellen den Mittelwert der normalisierten relativen Fluoreszenzeinheit pro Minute ±SD aus Dreifachmessungen dar. b Zusammenfassung der Hemmprofile für die drei natürlichen Verbindungen YRL, HBA, HE9 und die Kontrollverbindung GRL-0617 (TTT), erhalten aus Enzymaktivitätstests und antiviralen Zelllinientests.

Unter Berücksichtigung der beobachteten synergistischen Hemmwirkung in Kombination mit der molekularregulierenden antiviralen Homöostasefunktion von ISG15 im menschlichen Wirt untersuchten wir die Hemmwirkung der Verbindungen HE9, HBA und YRL auf die Virusreplikation und die zytopathische Wirkung in lebenden Zellen mithilfe der Vero-Zelllinie Untersuchungen. Es wurden zwei unterschiedliche Ansätze angewendet: die qRT-PCR-Reaktion wie zuvor beschrieben4,25 und der CellTiter-Glo-Assay, ein Luciferase-Reporter-Assay zur Bestimmung des in lebensfähigen Zellen vorhandenen ATP-Spiegels49. Screening-Experimente begannen bei 5 mM der drei Verbindungen und verwendeten eine 10-Punkt-Verdünnungsreihe von 1:10, wobei Infektionen bei einem Multiplizitätsfaktor (MOI) von 0,01 durchgeführt wurden. Die beiden Verbindungen HE9 und YRL zeigten eine Verringerung der Replikation viraler RNA (vRNA) mit IC50-Werten von 0,13 bzw. 1 µM, ohne damit verbundene Zelltoxizität bei 100 µM (Abb. 4a). Experimente zur Lebensfähigkeit der Zellen wurden gleichzeitig unter den gleichen Bedingungen in Abwesenheit von Viren durchgeführt und zeigten keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen bei Konzentrationen, in denen die Verbindungen antivirale Aktivität zeigten (Abb. 4b).

a Der Virustiter und die Zelllebensfähigkeit wurden durch qRT-PCR (●) bzw. CellTiter-Glo-Lumineszenzmethode (■) quantifiziert. Dargestellt sind IC50- und R-Quadrat-Werte für Virustiter. Die IC50-Werte wurden berechnet, indem die Daten wie zuvor beschrieben an die Sigmoidalfunktion angepasst wurden4. Die Konzentrationen der Verbindungen werden zur Interpolation im logarithmischen Maßstab dargestellt. HE9 wurde in DMSO auf eine Stammkonzentration von 100 mM verdünnt, während YRL in sterilem Wasser auf eine Stammkonzentration von 50 mM verdünnt wurde. Alle Verbindungen wurden bei –20 °C gelagert. Einzelne Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte ± SD aus vier unabhängigen Replikaten in zwei biologischen Experimenten. Die Werte wurden in einem Liniendiagramm dargestellt, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung anzeigen. b Die Lebensfähigkeit der Zellen in Gegenwart der drei Verbindungen wurde mit der CellTiter-Glo-Lumineszenzmethode bestimmt. Einzelne Datenpunkte aus drei unabhängigen Replikaten in drei biologischen Experimenten. c Die CPE-Hemmung wurde mit der CellTiter-Glo-Lumineszenzmethode bestimmt. IC50- und R-Quadrat-Werte werden angezeigt. IC50-Werte wurden durch Anpassen der Daten an die Sigmoidalfunktion berechnet. Einzelne Datenpunkte stellen Mittelwerte ± SD aus drei unabhängigen Replikaten in einem biologischen Experiment dar. Die Werte wurden in einem Liniendiagramm dargestellt, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung anzeigen.

Die Verbindung HE9 reduzierte die Replikation der viralen RNA (vRNA) unter den drei untersuchten Verbindungen erheblich und wurde weiter untersucht, um die wirksamen Konzentrationen zu bestimmen, die nicht nur die vRNA-Spiegel, sondern auch infektiöse Partikel des SARS-CoV-2-Virus durch Hemmung des zytopathischen Effekts (CPE) reduzieren können Test (Abb. 4c). Ein Wirkstoff war derjenige, der eine CPE-Hemmung von >50 % zeigte, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Es war uns nicht möglich, eine Sigmoidkurve an die Daten für die Verbindungen HBA und YRL anzupassen. Wichtig ist, dass die Behandlung der Zellen mit der Verbindung HE9 die Virusreplikation reduzierte und eine Fähigkeit zeigte, CPE mit IC50 = 10 µM zu hemmen (Abb. 4c). Diese Ergebnisse der Zelltests stimmen mit den enzymatischen In-vitro-Studien unter Verwendung von DeISGlyierungstests überein und zeigen deutlich, dass die Verbindung HE9 ein potenzieller Inhibitor von PLpro ist, der die Wirtszellen vor dem viralen CPE schützen kann.

PLpro von SARS-CoV, MERS-CoV und anderen Coronaviren sind in der Lage, die Komponenten von Typ-I-Interferon zu inaktivieren, teilweise vermittelt durch ihre Deubiquitinierungs- und DeISGylierungsfunktionen5,25. Ein einzigartiges Merkmal von Vero-Zellen ist, dass sie einen Interferon-Mangel aufweisen und nicht in der Lage sind, Interferone Typ I (IFN) zu produzieren, die antiviralen Signalproteine, die typischerweise von Säugetierzellen produziert werden50 und von denen bekannt ist, dass sie ISG15 stark exprimieren. Dadurch wurden die zelluläre Lebensfähigkeit, die Hemmung der Virusreplikation im mikromolaren Bereich und die wirksame Hemmung des zytopathischen Effekts in Gegenwart von HE9 in Vero-Zellen über einen alternativen zellulären Weg während der Infektion durch SARS-CoV-2 moduliert.

Aktuelle Studien, die ähnliche zellbasierte Protokolle zur Bewertung der Replikation von SARS-CoV-2 mit der Vero-Zelllinie verwenden, haben eine stabile virale Replikationskurve zwischen 24 und 40 Stunden nach der Infektion berichtet, gefolgt von einem offensichtlichen Rückgang der Replikation und einer starken zytopathischen Wirkung auf die zelluläre Lebensfähigkeit51. Diese Beobachtung wurde in unserer Studie nicht beobachtet, als die HE9-Verbindung in derselben Vero-Zelllinie titriert wurde. In derselben Studie wurde eine signifikante Hemmung der Virusreplikation festgestellt, wenn Vero-Zellen mit SARS-CoV-2 infiziert und unabhängig voneinander mit IFN-β1a und IFN-α (Typ-I-IFN) behandelt wurden. Darüber hinaus stimulierte die Behandlung nicht infizierter Vero-Zellen mit menschlichem Interferon Typ III (IFN-λ1) die endogene zelluläre Expression anderer ISGs wie MxA (Myxovirus-Resistenzprotein), PKR (Proteinkinase R), OAS-1 (2′, 5′-Oligoadenylat-Synthetase), SOCS-1 (Suppressor Of Cytokine Signaling 1) und Rig-1 (Retinsäure-induzierbares Gen I)52,53, was darauf hindeutet, dass Vero-Zellen, auch ohne Typ-I-IFNs, funktionelles IFN hervorrufen können III-Antworten54. Somit könnte die Verbindung HE9 indirekt die Virusaktivität abschwächen, indem sie die Deubiquitinierungsereignisse des Wirts umkehrt, die mit dem IFN-Reaktionsmangel in Vero-Zellen verbunden sind.

Wir haben drei phenolische Verbindungen identifiziert, die PLpro durch Bindung an eine allosterische S2-Stelle, eine Interaktions- und Bindungsregion für das ISG15-Molekül, hemmen. Alle drei Verbindungen zeigen in einem DeISGylierungstest eine Hemmung von PLpro und zeigen in einem mit der Hauptprotease Mpro durchgeführten enzymatischen Aktivitätstest keine Hemmung. Interessanterweise zeigten zwei Verbindungen in Vero-Zelllinien-Assays eine ausgeprägte antivirale Aktivität und eine Verbindung hemmte zusätzlich eine zytopathische Wirkung in nicht-zytotoxischen Konzentrationsbereichen. Die Bindungsaffinitäten für die drei Verbindungen liegen im unteren mikromolaren Bereich, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen schwach an PLpro binden, aber sicherlich wertvolle Ausgangsgerüste als Leitverbindungen liefern, die auf eine allosterische Bindungsstelle in PLpro abzielen. Molekulare Docking-Studien mit den drei Phenolverbindungen, die entweder kovalent mit den Thiosemicarbazon-Strukturen verbunden oder verlängert sind, zeigen einen Anstieg der vorhergesagten Bindungsenergien um 0,8–1,8 kcal/mol im Vergleich zu den nicht verlängerten Ausgangsverbindungen55. Somit können die beobachteten Bindungsaffinitäten und -spezifitäten der drei Verbindungen durch eine systematische SAR-Analyse (Struktur-Aktivitäts-Beziehung) verbessert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hochauflösenden PLpro-Komplexstrukturen mit den phenolischen Naturstoffen YRL, HBA und HE9, ergänzt durch enzymatische und zelluläre Tests, eine molekulare Grundlage zum Verständnis des Hemmmechanismus lieferten, einen Weg zur Entwicklung wirksamer PLpro-Inhibitoren von Substraten, die an PLpro binden S2-Helix-Bindungstasche und geben Aufschluss über die Art der ISGylierung von COVID-19-Virusproteinen als neuen Ansatz zur Verhinderung ihrer Interaktion mit zellulären Signalwegen des menschlichen Wirts. Wir glauben, dass dieser Ansatz zur Hemmung von PLpro die virale Fähigkeit zur DeISGylierung bei viralen Komplikationen nach COVID-19 behindern und verringern und außerdem mehr ISG15 im Lungengewebe für die Modulation der Zytokin-/Chemokinproduktion bereitstellen kann, um die Reparatur von zu unterstützen das respiratorische Epithel bei COVID-19-Infektionen11.

Ein Fragment des SARS-CoV-2-ORF pp1a/ab, das für die PLpro-Domäne kodiert und den Aminosäuren 746–1060 des Nichtstrukturproteins 3 (YP_009742610.1) entspricht, wurde in pETM11(EMBL) kloniert, das für N-terminale Hexa- Auf sein Tag folgt eine Spaltstelle für die Protease des Tabak-Etch-Virus (TEV). Nach der Spaltung durch TEV-Protease verbleiben zwei zusätzliche Aminosäuren (GA) am N-Terminus des PLpro-Konstrukts. Das für das gewünschte Konstrukt kodierende Plasmid wurde in E. coli Rosetta (DE3)-Zellen (Merck, Deutschland) transformiert, um die Expression über ein Autoinduktionsmedium durchzuführen, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben56 und unter Verwendung von Kanamycin zur Selektion. Eine Nachtzellkultur wurde verdünnt und in Autoinduktionsmedium mit 0,5 g L−1 β-D-Glucose und 2 g L−1 Lactose unter ständigem Schütteln für 4 Stunden bei 37 °C und anschließend in Gegenwart von 100 µM ZnCl2 zusätzlich inkubiert -Nacht bei 18 °C. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschallbehandlung in Lysepuffer (50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl und 10 mM Imidazol, pH 7,2) aufgeschlossen.

Zellextrakte wurden bei 4 ° C gehalten und 1 Stunde lang bei 12.000 × g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde mit Ni-NTA-Affinitätsharz (Thermo Fisher Scientific, USA) inkubiert. PLpro wurde durch Schwerkraftfluss unter Verwendung von Lysepuffer, ergänzt mit 300 mM Imidazol, eluiert und anschließend mit TEV-Protease in einem Molverhältnis von 20:1 in Gegenwart von 1 mM DTT inkubiert. Die Spaltung erfolgte während der Dialyse gegen 50 mM Tris, 150 mM NaCl und 1 mM DTT, eingestellt auf pH 7,3, und für 14 Stunden bei 8 °C. Nach der Entfernung der Protease und des abgespaltenen Tags durch Affinitätschromatographie wurde PLpro mithilfe der Größenausschlusschromatographie, d. h. einer HiLoad 16/600 Superdex 75-Säule, verbunden mit einem ÄKTA-Reiniger (GE Healthcare, GB), äquilibriert mit 50 mM Tris, 150, bis zur Homogenität gereinigt mM NaCl und 1 mM TCEP bei pH 7,5. Reinheit und Integrität des Proteins wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und DLS (Dynamic Light Scattering) überprüft. Die Konzentration von PLpro mit einem berechneten Molekulargewicht von 35.760 Da (εberechnet = 45.270 M−1 cm−1) wurde zur Vorbereitung von Dampfdiffusionskristallisationsversuchen auf 20 mg mL−1 eingestellt.

Erste Kristallisationsscreening-Experimente wurden unter Verwendung der Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen unter Verwendung des Oryx4-Roboters (Douglas Instruments) mit den SWISSCI 96-Well-Platten durchgeführt. Für erste Screening-Experimente wurden Wizard™ Classic 1, 2, 3 und 4, JCSG+, PACT-Kristallisationsformulierungen ausprobiert. Die Kristallisation wurde mit einem Protein:Reservoir-Verhältnis von 2:1 bei 4 und 20 °C durchgeführt. Erste Treffer wurden mit dem Wizard-Bildschirm, Bedingung G11 (0,1 M Acetatpuffer pH 4,5, 0,8 M NaH2PO4/1,2 M K2HPO4) bei 4 °C erhalten. Eine weitere Optimierung erfolgte durch Änderung des Puffers auf 0,1 M Tris-HCl, pH = 8,0 und Zugabe von 10 % Glycerin, was zu 0,2–0,3 mm großen bipyramidalen Kristallen führte. Diese Kristalle beugten Röntgenstrahlen mit einer Auflösung von 1,42 Å.

PLpro-Komplexkristalle mit Verbindungen wurden durch die Cokristallisationsmethode unter den gleichen Bedingungen wie oben zusammengefasst gezüchtet. 100 nL Tröpfchen von 10 mM Verbindungslösungen in DMSO von der Sadia Molecular Bank, Karachi-Bibliothek natürlicher Verbindungen, wurden auf eine SWISSCI-Platte mit 96 Vertiefungen aufgetragen und die Verbindungen wurden im Vakuum getrocknet, bevor 200 nL (20 mg/ml) hinzugefügt wurden. PLpro-Proteinlösung und 100 nL der Kristallisationsbedingung (0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0, 0,8 M NaH2PO4/1,2 M K2HPO4 und 10 % Glycerin). Die Tropfen wurden in einem Dampfdiffusionsaufbau mit sitzenden Tropfen mit 80 μl Reservoirlösung äquilibriert. Die Platten wurden bei 4 °C inkubiert und innerhalb von 2 Tagen bildeten sich Kristalle, die reproduzierbar auf eine Größe von ca. 1 cm wuchsen. 0,2 × 0,3 × 0,2 mm3 in 4 Tagen. Die Kristalle wurden manuell direkt aus dem Tropfen geerntet und zur Erfassung der Beugungsdaten in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Beugungsdaten der ligandenfreien und komplexen PLpro-Kristalle wurden an der Strahllinie P11, PETRA III/DESY, Hamburg gesammelt. Alle Datensätze von ligandenfreiem PLpro wurden mit dem Programm XDS57 mit einem Referenzdatensatz verarbeitet, um eine konsistente Indizierung sicherzustellen. Aus insgesamt 64 vollständigen Datensätzen wurden die stärksten basierend auf (I/σ)asymptotisch größer als 2058 ausgewählt. Diese 25 Datensätze wurden dann einer iterativen Zusammenführung unter Verwendung von CODGAS59 mit Standardparametern unterzogen. Die besten zusammengeführten Datensätze wurden weiter manuell gefiltert, was zum endgültigen Datensatz führte, der fünf Datensätze enthielt. Diese wurden mit XSCALE57 skaliert und die endgültige Zusammenführung und Auflösungsgrenze wurde mit AIMLESS60 angewendet. Die Strukturlösung wurde durch die molekulare Ersatzmethode mit PHASER61 unter Verwendung der PLpro-Koordinaten mit dem PDB-Code 7JRN als Suchmodell erreicht. Aufeinanderfolgende Runden der manuellen Erstellung mit dem Programm COOT62 und der Verfeinerung mit PHENIX63, die Zugabe von Phosphat-, Glycerin-, Chloridionen und Wasserlösungsmittelmolekülen zum Modell, gefolgt von einer abschließenden Runde der TLS-Verfeinerung, vervollständigten die Strukturverfeinerung mit einer Auflösung von 1,42 Å .

Für die Strukturlösung und Analyse von PLpro im Komplex mit den natürlichen Verbindungen aus der aus 500 Verbindungen bestehenden Bibliothek wurden eine automatische Datenverarbeitungspipeline, Trefferfindung, Clustering64, PanDDA-Analyse65 und Verfeinerungsprotokolle wie zuvor beschrieben4 verwendet. Die Datenverarbeitung mit XDS führte zu 1469 Datensätzen und umfasst mehr als einen Datensatz pro Verbindung. Die Datenqualitätsindikatoren CC1/2 und Wilson-B-Faktoren werden wie in Abb. S7 dargestellt dargestellt. Letzte Runden der manuellen Verfeinerung mit Refmac66 oder Phenix67 zusammen mit der manuellen Modellbildung unter Anwendung von COOT führten zu den endgültigen verfeinerten Strukturen. Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung für PLpro und Komplexe sind in Tabelle 1, Zusatzinformationen, zusammengefasst. Alle Abbildungen wurden mit PyMol68 erstellt

Aktivitätstests wurden für das native und mutierte Enzym SARS-CoV-2 PLpro (PLpro C111S-Mutante) durchgeführt, um die durch die drei natürlichen Verbindungen bewirkten DeISGylierungs- und Deubiquitinierungsaktivitäten gemäß zuvor veröffentlichten Protokollen zu bestimmen26,27,47. Die Tests wurden mit einem Gesamtreaktionsvolumen von 100 µL in einer nicht bindenden 96-Well-Platte mit schwarzem Boden durchgeführt und die Reaktionen wurden auf einem Tecan Infinite M plus-Plattenlesegerät (Tecan Group Ltd, Schweiz) unter Verwendung spezieller optischer Einstellungen für ISG15 gemessen -Rhodamin (UbiQ-127, UbiQ Bio) und Ubiquitin-Rhodamin (UbiQ-126, UbiQ Bio). ISG15-Rhodamin und Ub-Rhodamin sind fluorogene Substrate, die die von PLpro erkannte Spaltungssequenz RLRGG am C-Terminus enthalten. Durch die Spaltung der Amidbindung zwischen dem terminalen Glycinrest und dem Rhodamin110-Fluorophor wird das fluoreszierende Rh110-Morpholincarbonyl freigesetzt, was zu einem Anstieg der Fluoreszenzintensität führt, gemessen als RFU (Relative Fluoreszenzeinheit). Der Fluorophor hat eine Anregung und Emission bei 492 bzw. 525 nm. Das ISG15-Substrat (UbiQ-127) und das Ub-Substrat (UbiQ-126) wurden in einer Endkonzentration von 100 nM verwendet und die Konzentration von PLpro betrug im Assay 10 nM. Während des gesamten Tests wurden relevante Substrate und Positivkontrollen (GRL0617) verwendet. SARS-CoV-2 PLpro nativ, mutiert und Substrate wurden in Testpuffer verdünnt (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP) und die Reaktionen wurden nach Zugabe von PLpro in einem Endvolumen von 100 µL gestartet gemessen bei 25 °C. Die mutmaßlichen Inhibitorverbindungen wurden mit dem PLpro-Enzym 6 Stunden lang bei 10 °C inkubiert. Die Hemmungskinetik wurde in dreifacher Ausfertigung über 60 Minuten mit einer Messung pro Minute in zwei unabhängigen Experimenten gemessen. Die gemessenen Fluoreszenzwerte wurden mit Puffer, der entweder das ISG15-Rhodamin- bzw. das Ub-Rhodamin-Substrat enthielt, leer korrigiert.

Die IC50-Bestimmung wurde mit ISG15-Rhodamin als Substrat bei einer Konzentration von 250 nM durchgeführt. Die Tests wurden wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch wurde vor der Inkubation eine Gradientenkonzentration aller drei natürlichen Verbindungen und GRL-0617 in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 50 µM im Reaktionsgemisch verwendet. Die IC50-Werte wurden durch die Dosis-Wirkungs-Hemmungsfunktion nach der Normalisierung der enzymatischen Aktivitätswerte berechnet. Für die Analyse der Ergebnisse und die Erstellung entsprechender Abbildungen wurden Microsoft Excel und GraphPad Prism (Version 8.3.1) verwendet.

Vero-Zelllinien (ATCC® CCL-81™) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), kultiviert. Die Zellen wurden nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 3,5 × 104 Zellen/Well ausgesät. Das Zellkulturmedium wurde gewechselt und zehnfache Reihenverdünnungen der Verbindungen hinzugefügt. Die Lebensfähigkeit der Zellen nach 72-stündiger Behandlung der Zellen mit den jeweiligen Verbindungen wurde mithilfe des CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Das Lumineszenzsignal wurde mit einem CLARIOstar-Multimode-Mikroplattenlesegerät (BMG Labtech, Deutschland) aufgezeichnet. Die Daten wurden aus drei unabhängigen Replikaten in drei biologischen Experimenten gewonnen. Proben, bei denen es sich um technische Fehler und extreme Ausreißer handelte, wurden entfernt. Vertiefungen, die nur Kulturmedium enthielten, dienten als Kontrolle zur Bestimmung des Testhintergrunds.

Vero-Zelllinien (ATCC® CCL-81™), kultiviert in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, wurden nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 3,5 × 104 Zellen/Well ausgesät . Das Zellkulturmedium wurde gewechselt und den Zellen wurden zehnfache Reihenverdünnungen der Verbindungen zugesetzt. Die Tests wurden wie zuvor veröffentlicht4 durchgeführt. Kurz gesagt, nach 1-stündiger Inkubation wurde der SARS-CoV-2-Stamm 69, verdünnt in DMEM mit 2,5 % FBS, mit einer MOI von 0,01 zu den Zellen gegeben und 1 Stunde lang absorbiert. Das virale Inokulum wurde entfernt und die Zellen wurden vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Kalzium und Magnesium gewaschen. Frisches DMEM mit 2,5 % FBS, das die Verbindungen enthielt, wurde wieder auf die Zellen gegeben. Der Zellkulturüberstand wurde 42 Stunden nach der Infektion geerntet und die virale RNA wurde mit dem MagMAX™ Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific) gereinigt. Die Proben wurden mit der halbautomatischen NucliSENS® easyMag®-Plattform (bioMérieux, Lyon, Frankreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet. Alle SARS-CoV-2-Infektionen wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 am Institut für Biomedizinische Wissenschaften der Universität São Paulo, Brasilien, durchgeführt. Die Virustiter wurden mit der qRT-PCR-Methode unter Verwendung des AgPath-ID™ One-Step RT-PCR-Kits (Thermo Fisher Scientific) und einer Sequenz von Primern und Sonden für das E-Gen70 bestimmt. Die Virustiter wurden unter Verwendung einer Standardkurve berechnet, die mit Reihenverdünnungen einer bekannten Template-Konzentration erstellt und in TCID50/ml ausgedrückt wurde. Als Kontrolle dienten infizierte Zellen unter Zusatz von 0,5 % DMSO. Die IC50-Werte wurden durch Anpassen der Daten mit GraphPad Prism Version 8.00 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornien, USA) berechnet. Die Daten wurden aus vier unabhängigen Replikaten in zwei biologischen Experimenten gewonnen. Proben, bei denen es sich um technische Fehler und extreme Ausreißer handelte, wurden entfernt.

Vero-Zelllinien (ATCC® CCL-81™), kultiviert in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, wurden nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 3,5 × 104 Zellen/Well ausgesät . Das Zellkulturmedium wurde gewechselt und den Zellen wurden zehnfache Reihenverdünnungen der Verbindungen zugesetzt. Die Zellen wurden mit einer MOI von 0,01 infiziert und die Hemmung des zytopathischen Effekts (CPE) nach 42-stündiger Behandlung der Zellen mit den jeweiligen Verbindungen wurde mittels CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) bestimmt. Das Lumineszenzsignal wurde mit einem CLARIOstar-Multimode-Mikroplattenlesegerät (BMG Labtech, Deutschland) aufgezeichnet. Die Daten wurden aus drei unabhängigen Replikaten in einem biologischen Experiment erhalten. Proben, bei denen es sich um technische Fehler und extreme Ausreißer handelte, wurden entfernt.

Der lumineszenzbasierte Assay misst die Hemmung des SARS-CoV2-induzierten zytopathischen Effekts (CPE) in der Vero-Zelllinie (ATCC® CCL-81™)49. Die prozentuale Hemmung des zytopathischen Effekts (CPE) wurde als [(Testverbindung – Viruskontrolle)/(Zellkontrolle – Viruskontrolle)] × 100 definiert. Die IC50-Werte wurden durch Sigmoidalfunktion unter Verwendung von GraphPad Prism Version 8.00 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornien, USA) angepasst ).

nDSF-Messungen wurden mit einem Nanotemper Prometheus NT.48-Fluorimeter (Nanotemper) durchgeführt, das mit der PR.ThermControl-Software betrieben wurde, und unter Verwendung von Prometheus Premium-Kapillaren (Nanotemper). Die Anregungsleistung wurde angepasst, um Fluoreszenzsignale über 2000 RFU für einen Wellenlängenbereich von 330 und 350 nm zu erhalten. Für alle Messungen wurde eine PLpro-Konzentration von 50 μM im Puffer bestehend aus 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, pH 8,0 und variierenden Ligandenkonzentrationen verwendet. Für den Liganden HE9 wurden 0,5 % DMSO zugesetzt, um die Löslichkeit sicherzustellen. Für die Fluoreszenztitrationen wurde eine 1:1-Verdünnungsreihe mit 16 Ligandenpunkten entworfen und anschließend mit den entsprechenden Proteinlösungen versetzt. Die Ligandenkonzentrationen reichen von 20 mM bis 610 nM für HBA und 5 mM bis 153 nM für HE9. Nach 30-minütiger Inkubation wurden die Lösungen in Kapillaren überführt und für die Messungen verwendet. Die Daten wurden mithilfe selbst geschriebener Python-Skripte unter Verwendung der Python-Module Numpy, Matplotlib, Scipy und Pandas sowie einer öffentlich verfügbaren SPC-Datenanalyseplattform analysiert und visualisiert.46 Die Fluoreszenzwerte F vs. die Ligandenkonzentration [L]0 von HBA und HE9 wurden mit einem einfachen 1:1-Bindungsmodell unter Verwendung der Gleichungen ausgestattet. (1) und (2) unten:

Für SARS-CoV-2 Mpro16,71 wurden Aktivitätstests unter Verwendung der drei natürlichen Verbindungen durchgeführt, um die Spezifität der Verbindungen gegenüber PLpro zu charakterisieren. Die Tests wurden unter Verwendung eines Gesamtreaktionsvolumens von 50 µL unter Verwendung von nicht bindenden 96-Well-Platten mit schwarzem Boden durchgeführt und die relative Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Tecan Infinite M plus-Plattenlesegeräts (Tecan Group Ltd, Schweiz) unter Verwendung spezifischer optischer Einstellungen gemessen das Substrat 2-AbzSAVLQSGTyr(3-NO2)R-OH (Biotrend). Das entsprechende Fluorophor weist eine Anregung und Emission bei einer Wellenlänge von 355 nm bzw. 460 nm auf. Das Substrat und Mpro wurden in einer Endkonzentration von 5 µM bzw. 75 nM verwendet. Der bekannte Mpro-Inhibitor (GC-376) wurde während des gesamten Tests als Positivkontrolle verwendet. SARS-CoV-2 Mpro und Substrate wurden in Testpuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,3, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) verdünnt und die Reaktionen wurden nach Zugabe von Mpro in einem Endvolumen von 50 µL gestartet wurden bei 25 °C gemessen. Die drei Verbindungen wurden vor den Experimenten mit Mpro 6 Stunden lang bei 10 °C inkubiert, wie dies auch für die PLpro-Aktivitätstests der Fall war. Die Fluoreszenzwerte wurden 15 Minuten lang mit einer Auslesung pro Minute gemessen.

Die IC50-Bestimmung wurde unter Verwendung desselben Substrats in einer Konzentration von 5 µM durchgeführt und die entsprechenden Tests wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Für alle drei Naturstoffe und GC-376 wurde ein Konzentrationsgradient im Bereich von 1 nM–150 µM verwendet. Die IC50-Werte wurden unter Anwendung einer Dosis-Wirkungs-Hemmungsfunktion nach Normalisierung der enzymatischen Aktivitätswerte berechnet. Für die Analyse der gewonnenen Daten zur Erstellung der entsprechenden Zahlen wurden Microsoft Excel und die Software Origin (OriginLab) verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Koordinaten und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank PDB mit den Codes 7NFV (PLpro), 7OFS (PLpro im Komplex mit YRL, 4-(2-Hydroxyethyl)phenol), 7OFT (PLpro im Komplex mit HBA, p-Hydroxybenzaldehyd) hinterlegt ) und 7OFU (PLpro im Komplex mit HE9, 3, 4-Dihydroxybenzoesäure, Methylester).

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Die Autoren widmen diesen Artikel zu Ehren des 80. Geburtstages von Prof. Dr. Atta-ur-Rahman, dem Gründer des ICCBS (International Center for Chemical and Biological Sciences), Karachi, Pakistan, für seine wissenschaftlichen Beiträge und seine Arbeit in der Erforschung und Weiterentwicklung von Naturprodukten der Wissenschaft und Förderung des wissenschaftlichen Nachwuchses. Wir danken dem Deutschen Elektronen-Synchrotron (DESY, Hamburg, Deutschland), einem Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft HGF, für die Bereitstellung experimenteller Einrichtungen, dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) über die Projekte 05K2020, 05K19GU4, 13K20GUB, 05K19GU1 Joachim-Herz-Stiftung Hamburg (Projekt Infecto-Physics), die Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Projekte 2015/26722-8 und 2020/12277-0) und das Kooperationsnetzwerk zwischen den Universitäten São Paulo ( USP) und Hamburg (UHH) über das UHH-USP-FAPESP Sprint Project 2019 (FAPESP 2019/00899-0) und das USP-UHH Joint Venture „4D – From Drug Discovery to Drug Delivery“. Die Autoren danken außerdem für die Unterstützung des Exzellenzclusters „Advanced Imaging of Matter“ der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) – EXC 2056 – Projekt-ID 390715994. Wir würdigen auch die Beiträge der ICCBS-Mitarbeiter Prof. Dr. M. Iqbal Choudhary, Prof. Dr. Bina S. Siddiqui, Prof. Dr. Shaiq Ali, Prof. Dr. Sabira Begum und Prof. Dr. Atia-tul-Wahab für die Bereitstellung der Bibliothek der in diesem Manuskript erwähnten Verbindungen.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Fachbereich Chemie, Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Labor für Strukturbiologie von Infektionen und Entzündungen, Universität Hamburg, Bau. 22a, c/o DESY, 22607, Hamburg, Deutschland

Vasundara Srinivasan, Hevila Brognaro, Prince R. Prabhu, Sven Falke, Nadine Werner, Hina Andaleeb, Najeeb Ullah, Bruno Alves Franca, Mengying Wang, Angelica Luana C. Barra, Markus Perbandt, Martin Schwinzer und Christian Betzel

Hamburg Centre for Ultrafast Imaging (CUI), Universität Hamburg, Luruper Chaussee 149, 22761, Hamburg, Germany

Prinz R. Prabhu, Thomas J. Lane, Arwen R. Pearson, Henry N. Chapman und Christian Betzel

Abteilung für Parasitologie, Institut für Biomedizinische Wissenschaften der Universität São Paulo, São Paulo, Brasilien

Edmarcia Elisa de Souza & Carsten Wrenger

Center for Free-Electron Laser Science, CFEL, Deutsches Elektronen-Synchrotron DESY, Notkestraße 85, 22607, Hamburg, Deutschland

Sebastian Günther, Patrick Y. A. Reinke, Thomas J. Lane, Wiebke Ewert, Janina Sprenger, Faisal H. M. Koua, Sven Falke, Oleksandr Yefanov, Julia Lieske, Luca Gelisio, Martin Domaracky, Philipp Middendorf, Michael Groessler, Fabian Trost, Marina Galchenkova, Aida Rahmani Mashhour, Henry N. Chapman & Alke Meents

Diamond Light Source Ltd. Diamond House, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, OX11 0DE, Großbritannien

Helen Ginn

European XFEL GmbH. Holzkoppel 4, 22869, Schenefeld, Germany

Huijong Han, Christina Schmidt, Lea Brings, Kristina Lorenzen & Robin Schubert

Abteilung für Biochemie, Bahauddin Zakariya University Multan-, 60800, Punjab, Pakistan

Hina Andaleeb & Najeeb Ullah

TerRa Pole, São Carlos Institute of Physics, Universität São Paulo, São Carlos, Brasilien

Angélica Luana C. Barra

Abteilung für Mikrobiologie, Institut für Biomedizinische Wissenschaften der Universität São Paulo, São Paulo, Brasilien

Rafael Rahal Guaragna Machado, Erika Donizette Candido, Danielle Bruna Leal Oliveira und Edison Luiz Durigon

Klinisches Labor, Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, Brasilien

Danielle Bruna Leal Oliveira

Wissenschaftliche Plattform Pasteur USP, São Paulo, Brasilien

Edison Luiz Durigon

Europäisches Labor für Molekularbiologie Hamburg, c/o DESY, Notkestraße 85, 22607, Hamburg, Deutschland

Stephan Niebling, Angelica Struve Garcia und Maria Garcia Alai

Photon Science, Deutsches Elektronen Synchrotron (DESY), Notkestrasse 85, 22607, Hamburg, Germany

Sofiane Saouane & Johanna Hakanpää

Fraunhofer-Institut für Translationale Medizin und Pharmakologie (ITMP), Schnackenburgallee114, 22525, Hamburg, Deutschland

Markus Wolf

Abteilung für Biochemie und Molekular- und Strukturbiologie, Jozef-Stefan-Institut, Jamova 39, 1 000, Ljubljana, Slowenien

Dusan Turk

Kompetenzzentrum für integrierte Ansätze in der Chemie und Biologie von Proteinen (CIPKEBIP), Jamova 39, 1 000, Ljubljana, Slowenien

Dusan Turk

Institut für Nanostruktur- und Festkörperphysik, Universität Hamburg, Luruper Chaussee 149, 22761, Hamburg, Germany

Arwen R. Pearson

Department of Physics, Universität Hamburg, Luruper Chaussee 149, 22761, Hamburg, Germany

Henry N. Chapman

Institute of Biochemistry, Universität Greifswald, Felix-Hausdorff-Str. 4, 17489, Greifswald, Germany

Winfried Hinrichs

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Von VS, HB, EES, HNC, ARP, AM, CW und CB konzipierte Forschung. VS, HB, PRP, EES, HNC, CW und CB haben das Manuskript geschrieben. HH, NW, SF, BNF, MW, ALCB, ARM und MW waren an der Probenvorbereitung beteiligt. VS führte Kristallisationsexperimente durch. VS, S. Günther, PR, JL, OY, SS, JH, HA, NU, MP, MS, FHMK, WE, JS, SF, M. Groessler, FT und M. Galchenkova führten eine Röntgendatenerfassung durch. VS, TJL, HG, S. Günther, PR, WE, JS, FHMK, DT und WH führten eine Röntgendatenanalyse durch. KL, LB, CS, HH, RS, LG, MD und PM führten die Röntgendatenverwaltung durch. VS, HB, PRP und PR führten und analysierten PLpro- und Mpro-Enzymaktivitätstests. EES, RRGM, EDC, DBLO und ELD führten Tests zur antiviralen Aktivität durch und analysierten sie. MGA, SN und ASG führten nanoDSF-Bindungsstudien durch und analysierten sie.

Korrespondenz mit Vasundara Srinivasan oder Christian Betzel.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Rui Xiong und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Srinivasan, V., Brognaro, H., Prabhu, PR et al. Antivirale Aktivität natürlicher Phenolverbindungen im Komplex an einer allosterischen Stelle der SARS-CoV-2-Papain-ähnlichen Protease. Commun Biol 5, 805 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03737-7

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Eingegangen: 15. Dezember 2021

Angenommen: 18. Juli 2022

Veröffentlicht: 11. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03737-7

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