Die alte Heilpflanze Rosmarin enthält eine hochwirksame Isoform

Dec 20, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 644 (2023) Diesen Artikel zitieren

1054 Zugriffe

15 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (Kv) in der KCNQ-Unterfamilie spielen eine wesentliche Rolle im Nervensystem, im Herzen, in der Muskulatur und im Epithel. Verschiedene heteromere KCNQ-Komplexe erfüllen wahrscheinlich unterschiedliche Funktionen im Gehirn, es fehlen jedoch Heteromer-Subtyp-spezifische kleine Moleküle für Forschung oder Therapie. Rosmarin (Salvia rosmarinus) ist eine immergrüne Pflanze, die seit Jahrtausenden medizinisch bei neurologischen und anderen Erkrankungen eingesetzt wird. Hier berichten wir, dass Rosmarinextrakt ein hochwirksamer Öffner heteromerer KCNQ3/5-Kanäle ist, mit schwachen Auswirkungen auf KCNQ2/3. Mithilfe eines funktionellen Screenings stellen wir fest, dass Carnosinsäure, ein phenolisches Diterpen aus Rosmarin, ein wirksamer, hochwirksamer, PIP2-depletionsresistenter KCNQ3-Öffner mit geringerer Wirkung auf KCNQ5 und keiner auf KCNQ1 oder KCNQ2 ist. Carnosinsäure ist außerdem hochselektiv für KCNQ3/5 gegenüber KCNQ2/3-Heteromeren. Medizinische Chemie, In-silico-Docking und Mutagenese zeigen, dass die Carboxylat-Guanidinium-Ionenbindung mit einem S4-5-Linker Arginin der KCNQ3-Öffnungsfähigkeit von Carnosinsäure zugrunde liegt, deren Auswirkungen auf KCNQ3/5 auf ein einzigartiges therapeutisches Potenzial und eine molekulare Grundlage für die Antike schließen lassen Neurotherapeutischer Einsatz von Rosmarin.

Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (Kv) bieten K+-Ionen die Möglichkeit, in einem streng regulierten Prozess schnell durch die Plasmamembran zu diffundieren, was für die Erregbarkeit der Zellen und die rechtzeitige Repolarisierung der Zellmembran unerlässlich ist. Kv-Kanäle in der KCNQ-Unterfamilie (Kv7) sind außerordentlich vielfältig hinsichtlich der Rollen, die sie erfüllen, der Gewebe, in denen sie exprimiert werden, und der physiologischen Prozesse, die sie ermöglichen1. Diese Vielseitigkeit lässt sich zu einem großen Teil durch die Fähigkeit der porenbildenden KCNQ-α-Untereinheiten zur Heteromultimerisierung erklären, sowohl untereinander als auch mit regulatorischen Untereinheiten – insbesondere denen der Single-Pass-Transmembran-KCNE-Untereinheiten. Die Bildung von Komplexen mit KCNE-Untereinheiten ist besonders wichtig für KCNQ1, das mit jeder der fünf KCNE-Isoformen (1–5) Komplexe mit dramatisch unterschiedlichen Eigenschaften bilden kann, die eine Rolle in verschiedenen Geweben, einschließlich Herz, Schilddrüse, Bauchspeicheldrüse, Innenohr und Magen-Darm-Trakt, ermöglichen und Plexus choroideus2. Bei KCNQ2–5 ergibt sich der größte Teil der Diversität aus der Heteromerisierung innerhalb der Unterfamilie3,4,5, obwohl KCNQ4/5-Kanäle beispielsweise Komplexe mit KCNE4 im Gefäßsystem bilden6,7.

Im Zentralnervensystem sind die primären KCNQ-Untereinheiten KCNQ2, 3 und 5, wobei angenommen wird, dass KCNQ4 ein eingeschränkteres Expressionsprofil in Hörneuronen (und Haarzellen des Innenohrs) aufweist. KCNQ2/3-Heteromere gelten als der dominierende neuronale KCNQ-Kanaltyp und als der wichtigste für die Erzeugung des neuronalen M-Stroms (Muskarinrezeptor-inhibierter Strom), der für die Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit wesentlich ist. Tatsächlich fungieren KCNQ2/3-Kanäle als neuronale Gatekeeper, die sich am Anfangssegment des Axons befinden und steuern, ob sich Aktionspotentiale ausbreiten oder nicht. Eine verringerte Aktivität von KCNQ2 oder KCNQ3 durch Mutationen mit Funktionsverlust beim Menschen, Knockout bei Mäusen oder pharmakologische Hemmung führt zu neuronaler Übererregbarkeit und Störungen einschließlich Anfällen und Entwicklungsverzögerungen. KCNQ3/5-Kanäle können auch im ZNS vorkommen, und KCNQ2/5- und KCNQ2/3/5-Komplexe wurden kürzlich mithilfe proteinchemischer Techniken nachgewiesen3,4,5.

KCNQ2-Funktionsverlust-Genvarianten stehen in engem Zusammenhang mit epileptischer Enzephalopathie bei Neugeborenen, aber auch KCNQ3- und KCNQ5-Funktionsverlust-Mutationen sowie Funktionsgewinn-Mutationen bei allen dreien sind mit Epilepsie in unterschiedlichem Ausmaß verbunden Schweregrad und Entwicklungsverzögerung8,9,10.

Das Verständnis der Rolle neuronaler KCNQ-Isoformen in der neurologischen Physiologie und Krankheit ist angesichts der kombinatorischen Komplexität der verschiedenen möglichen heteromeren KCNQ-Komplexe im ZNS, ihrer unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Expression, der potenziell dynamischen Natur ihrer Expression und der Möglichkeit sowohl homomerer als auch heteromerer Formen eine Herausforderung KCNQ-Kanäle werden ausgedrückt4. Spezifische kleine Moleküle mit der Fähigkeit, zwischen verschiedenen KCNQ-Heteromeren im Gehirn für Forschungs- und/oder Therapiezwecke zu unterscheiden, fehlen und sind dringend erforderlich. Wir erforschen das Potenzial von Pflanzen als chemische Fabriken zur Bereitstellung selektiver Ionenkanalmodulatoren, oft geleitet von der traditionellen Verwendung botanischer Volksmedizin11,12,13,14,15,16. Hier berichten wir, dass Rosmarin (Salvia rosmarinus), der seit Jahrtausenden in der traditionellen Medizin, insbesondere bei neurologischen Störungen und zur Verbesserung des Gedächtnisses, verwendet wird, ein wirksamer neuronaler KCNQ-Kanalaktivator mit einzigartiger Heteromerselektivität ist, für den wir die molekularen mechanistischen und chemischen Grundlagen erklären.

Rosmarin ist eine immergrüne Blütenpflanze mit nadelförmigen, aromatischen Blättern (Abb. 1a) und zarten weißen bis blassblauen Blütenbüscheln (Abb. 1b). Angesichts der langen Geschichte der traditionellen medizinischen Verwendung von Rosmarin für eine Reihe angeblicher Wirkungen, darunter beruhigende, schmerzstillende, antiparalytische und gedächtnissteigernde Wirkungen17, haben wir Rosmarinextrakt (1 %) auf Wirkungen auf KCNQ-Kanäle getestet, die einen großen Einfluss auf die Nervenfunktion haben , zunächst als Homomere, die in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert werden. Der Rosmarinextrakt hatte keinen Einfluss auf endogene Ströme, die von Eizellen aufgezeichnet wurden, denen Wasser anstelle von KCNQ-cRNA injiziert wurde (Abb. 1c). Rosmarinextrakt veränderte auch nicht die KCNQ1-Stromstärke (Abb. 1d) oder die KCNQ1-Spannungsabhängigkeit (Abb. 1e, f). oder das Ruhemembranpotential (EM) von nicht abgeklemmten Eizellen, die KCNQ1 exprimieren (Abb. 1g).

ein Salvia rosmarinus-Blätter (Bild: Bo Abbott, Verwendung mit Genehmigung). b Blüten von Salvia rosmarinus (Bild: GWA). c Mittlere Spuren für mit Wasser injizierte Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von 1:100 RAP-Extrakt. Gestrichelte Linien zeigen hier und überall die Nullstromlinie an. Maßstabsbalken unten links für jede Spur; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 5 pro Gruppe. d Mittlere Spuren für KCNQ1–3-Homere, die in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von 1:100 RAP-Extrakt exprimiert werden. Maßstabsbalken unten links für jede Spur; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 5–10 pro Gruppe. e Mittlerer Schweifstrom für Spuren wie in (d); n = 5–10 pro Gruppe. f Mittlerer normalisierter Schweifstrom (G/Gmax) für Spuren wie in (d); n = 5–10 pro Gruppe. g Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für KCNQ1–3-Homomer-exprimierende Oozyten wie in d; n = 5 pro Gruppe. h Mittlere Stromfaltenzunahme gegenüber dem Membranpotential für Spuren wie in d als Reaktion auf 1:100 RAP-Extrakt; n = 5–10 pro Gruppe. i Mittlere ΔV0,5-Aktivierung für Spuren wie in (d) als Reaktion auf 1:100 RAP-Extrakt; n = 5–10 pro Gruppe. Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an. Statistische Vergleiche durch gepaarten T-Test oder einfache ANOVA. RAP-Rosmarin-Luftteile.

Rosmarinextrakt hyperpolarisierte die Aktivierungsspannungsabhängigkeit von homomerem KCNQ2 und KCNQ3 * (KCNQ3-A315T, eine Mutante, die es homomerem KCNQ3 ermöglicht, robuste Ströme zu leiten) schwach (Abb. 1d – f). Dieser Effekt ermöglichte eine moderate (~10 mV) EM-Hyperpolarisation durch Rosmarinextrakt von Eizellen, die KCNQ3 exprimieren (mit einem statistisch nicht signifikanten Trend für Eizellen, die KCNQ2 exprimieren) (Abb. 1g). Die durch Rosmarinextrakt induzierten Stromsteigerungen waren bei –40 bis –60 mV am größten und bei KCNQ3* höher als bei KCNQ2 (Abb. 1h). Die Verschiebung der Spannungsabhängigkeit der durch Rosmarinextrakt induzierten Aktivierung war für KCNQ2 und KCNQ3 * ähnlich (~ –10 mV) (Abb. 1i; Ergänzungstabelle 1).

Die mäßige Wirkung von Rosmarinextrakt auf die Homomere scheint nicht ausreichend zu sein, um die therapeutische Wirkung von Rosmarin zu erklären. Daher haben wir als nächstes Extrakte aus verschiedenen Rosmarinpflanzenteilen am vorherrschenden M-Strom erzeugenden Heteromer, KCNQ2/3, getestet. Wir fanden heraus, dass alle drei im Wesentlichen ähnliche, geringfügige Anstiege des Stroms bei hyperpolarisierten Potentialen (Abb. 2a, b), Hyperpolarisierung in der Spannungsabhängigkeit der KCNQ2/3-Aktivierung (–7 bis –10 mV) (Abb. 2c – e) und induzierten Hyperpolarisation von EM (Abb. 2f). Keiner der getesteten Rosmarinteile beeinflusste die Aktivierungsrate durchweg (Abb. 2g), aber jeder der drei Teile verlangsamte durchweg die Deaktivierung (Abb. 2h). Da die Auswirkungen auf KCNQ2/3-Heteromere moderat waren, testeten wir KCNQ3/5, ein Heteromer, von dem angenommen wird, dass es auch M-Strom erzeugt19,20. Unerwarteterweise öffnete Rosmarinextrakt (1/100) KCNQ3/5 stark (Abb. 2i), was zu einer Verschiebung der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung um –28 mV und einer Abflachung der Steigung der Spannungsabhängigkeit (von 7,9 auf 12,1 mV) führte. sodass 20 % der KCNQ3/5-Kanäle bei –120 mV geöffnet waren (Abb. 2j, k; Ergänzungstabelle 2). Dies führte zu einer Hyperpolarisierung von EM um –17 mV und verschob sie auf den für EK erwarteten Wert (Abb. 2l).

a Mittlere Spuren für KCNQ2/3-Heteromere, die in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von 1:100 Extrakt aus Rosmarinteilen, wie angegeben, exprimiert werden. Maßstabsbalken unten links für jede Spur; Spannungsprotokoll unterer Einschub; n = 5–11 pro Gruppe. b Mittlerer Schweifstrom für KCNQ2/3-Spuren wie in a; n = 5–11 pro Gruppe. c Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ2/3-Spuren wie in a; n = 5–11 pro Gruppe. d Mittlerer Anstieg der Stromstärke gegenüber dem Membranpotential für KCNQ2/3-Spuren wie in A als Reaktion auf 1:100-Extrakte wie angegeben; n = 5–11 pro Gruppe. e. Mittlere ΔV0,5-Aktivierung für KCNQ2/3-Spuren wie in (a) als Reaktion auf 1:100-Extrakte wie angegeben; n = 5–11 pro Gruppe. f Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für KCNQ2/3-exprimierende Oozyten wie in (a); n = 5–11 pro Gruppe. g Mittlere Aktivierungsrate für KCNQ2/3-Spuren wie in (a) als Reaktion auf 1:100-Extrakte wie angegeben; n = 5–11 pro Gruppe. h Mittlere Deaktivierungsrate für KCNQ2/3-Spuren wie in (a) als Reaktion auf 1:100-Extrakte wie angegeben; n = 5–11 pro Gruppe. i Mittlere Spuren für KCNQ3/5-Heteromere, die in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von 1:100-Extrakt aus Rosmarin-Luftteilen exprimiert werden. Maßstabsbalken unten links; Spannungsprotokoll wie in (a); n = 5. j Mittlerer Schwanzstrom für KCNQ3/5-Spuren wie in (i); n = 5. k Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ3/5-Spuren wie in (i); n = 5. l Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für KCNQ3/5-Heteromer-exprimierende Oozyten wie in (i); n = 5. Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an. Statistische Vergleiche durch gepaarten T-Test oder einfache ANOVA. RAP-Rosmarin-Luftteile, RF-Rosmarinblüte, RS-Rosmarinstängel.

Als nächstes untersuchten wir Verbindungen, die zuvor für die Zusammensetzung des Rosmarinextrakts21 verwendet wurden, um die molekulare Grundlage für seine KCNQ-modulierenden Wirkungen zu entdecken, wobei wir uns zunächst auf KCNQ3 konzentrierten. Ein Screening mit 7 Verbindungen (Abb. 3a) bei jeweils 100 µM (mit Ausnahme von Hesperidin, das bis zu 30 µM löslich war) ergab, dass das phenolische Diterpen Carnosinsäure ein hochwirksamer KCNQ3*-Öffner ist, der eine negative Verschiebung von –62 mV induziert Spannungsabhängigkeit der Aktivierung (V0,5act) bei 100 µM und Förderung einer robusten Aktivität selbst bei –120 mV (Abb. 3b – d). Darüber hinaus induzierten Hesperidin und Chinasäure jeweils ~–10 mV-Verschiebungen in KCNQ3* V0.5act (Abb. 3d; Ergänzungstabelle 3). Nur Carnosinsäure und Hesperidin hyperpolarisierten die EM von Zellen, die KCNQ3* exprimierten (Abb. 3e).

a Jmol-Diagramme der Struktur (oben) und der Oberflächenladung (unten) für Rosmarinverbindungen wie angegeben. b Mittlere Spuren für KCNQ3*-Homere, die in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von 30–100 µM Rosmarinverbindungen exprimiert werden, wie angegeben. Maßstabsbalken unten links für jede Spur; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 3–5 pro Gruppe. c Mittlerer Schwanzstrom für KCNQ3*-Spuren wie in (b); n = 3–5 pro Gruppe. d Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ3*-Spuren wie in (b); n = 3–5 pro Gruppe. e Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für KCNQ3*-exprimierende Oozyten wie in (b); n = 3–5 pro Gruppe. Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an. Statistische Vergleiche durch gepaarten T-Test oder einfache ANOVA.

Bei 5 µM verstärkte Carnosinsäure den KCNQ3*-Strom beim Einwaschen deutlich auf –60 mV und erreichte nach etwa 150 s die Sättigung, während das Auswaschen des Effekts viel langsamer verlief (Abb. 4a). Der EC50-Wert für den Stromanstieg bei –60 mV betrug 5,43 ± 0,37 µM (Abb. 4b); der EC50-Wert für ΔV0,5act betrug 18 ± 0,72 µM (Abb. 4c) und der EC50-Wert für die EM-Verschiebung von nicht geklemmten Eizellen, die KCNQ3* exprimierten, betrug 1,19 ± 0,19 µM (Abb. 4d). Carnosinsäure verdoppelte spannungsunabhängig die Aktivierungsrate (Abb. 4e, f) und verlangsamte spannungsabhängig die Deaktivierungsrate (> vierfach bei –120 mV) (Abb. 4g, h) von KCNQ3*. Im Gegensatz dazu war Carnosinsäure im getesteten Konzentrationsbereich nur schwach gegen KCNQ2 und KCNQ2/3 aktiv (Abb. 4i – n; Ergänzungstabelle 4). Somit ist Carnosinsäure für KCNQ3 gegenüber KCNQ2 hochselektiv, und die verringerte Empfindlichkeit von KCNQ2 gegenüber Carnosinsäure ist bei KCNQ2/3-Heteromeren vorherrschend.

ein Beispieldiagramm, das das Einwaschen (rot) und das teilweise Auswaschen (schwarz) von Carnosinsäure (5 µM) bei –60 mV auf KCNQ3*, ausgedrückt in Eizellen, zeigt. Oberer Einschub, Carnosinsäure-Struktur. b Mittlerer Stromanstieg gegenüber [Carnosinsäure] bei –60 mV für KCNQ3*; n = 5 pro Gruppe. c Mittelwert ΔV0,5act gegenüber [Carnosinsäure] für Oozyten, die KCNQ3* exprimieren; n = 5 pro Gruppe; Spannungsprotokoll wie in Abb. 3b. d Mittlere EM gegenüber [Carnosinsäure] für nicht abgeklemmte Eizellen, die KCNQ3* exprimieren; n = 5 pro Gruppe. e Mittlere Kurven für KCNQ3*, die die Wirkung von Carnosinsäure (3 µM) (rot) auf die Aktivierung zeigen. Maßstabsbalken unten links; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 5 pro Gruppe. f Mittlere Aktivierungsrate gegenüber der Spannung für KCNQ3*-Spuren wie in f über den Spannungsbereich in Abwesenheit (schwarze Kreise) oder Anwesenheit (offene rote Kreise) von 3 µM Carnosinsäure; n = 5 pro Gruppe. g Mittlere Spuren für KCNQ3*, die die Wirkung von Carnosinsäure (3 µM) auf die Deaktivierung zeigen. Maßstabsbalken unten links für jede Spur; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 8 pro Gruppe. h Mittlere Deaktivierungsrate gegenüber der Spannung für KCNQ3*-Spuren wie in g in Abwesenheit (schwarze Kreise) oder Anwesenheit (offene rote Kreise) von 3 µM Carnosinsäure; n = 8 pro Gruppe. i Mittlere Spuren für KCNQ2, exprimiert in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit (blau) von 100 µM Carnosinsäure. Maßstabsbalken unten links; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 5 pro Gruppe. j Mittlere Spuren für KCNQ2/3, exprimiert in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit (braun) von 100 µM Carnosinsäure. Maßstabsbalken unten links; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 5 pro Gruppe. k Mittlerer Schwanzstrom und normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ2-Spuren wie in (I); n = 5 pro Gruppe. l Mittlerer Schwanzstrom (links) und normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) (rechts) für KCNQ2/3-Spuren wie in (j); n = 5 pro Gruppe. m Mittelwert ΔV0,5act gegenüber [Carnosinsäure] für Oozyten, die KCNQ2 oder KCNQ2/3 exprimieren, mit KCNQ3*-Daten aus Panel c zum Vergleich; n = 5 pro Gruppe; Spannungsprotokoll wie in (I). n .Mittelwert ΔEM versus [Carnosinsäure] für Oozyten, die KCNQ2 oder KCNQ2/3 exprimieren, mit KCNQ3*-Daten (berechnet aus Panel d) zum Vergleich; n = 5 pro Gruppe; Spannungsprotokoll wie in Panel i. Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an.

Unter Ausgangsbedingungen ist die Bindung des löslichen, aus Lipiden stammenden Signalmoleküls Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) an KCNQ3 (und andere KCNQ-Isoformen) für eine effiziente Kopplung des Spannungssensors an die Porenöffnung und damit für eine spannungsabhängige Steuerung erforderlich22, 23. Hier reduzierte die Reduzierung der PIP2-Spiegel durch Vorbehandlung mit Wortmannin die aktuelle Stärke von KCNQ3* um das Fünffache, dennoch war Carnosinsäure (5 µM) immer noch in der Lage, KCNQ3* V0.5act (Abb. 5a, b) und EM (Abb. 5c) zu verschieben. unter diesen Bedingungen, obwohl der ΔV0.5act etwa 50 % des Werts unter PIP2-reichen Bedingungen betrug (Abb. 5d). Eine weitere Strategie zur PIP2-Reduktion besteht darin, eine spannungsempfindliche Phosphatase (VSP) zu exprimieren, die die PIP2-Spiegel bei Membrandepolarisation reduziert24. Hier haben wir das Danio rerio VSP (DrVSP)25 mit KCNQ3* koexprimiert und festgestellt, dass der KCNQ3*-Strom nach 12 s bei +120 mV um 50 % abfiel. Bemerkenswerterweise reduzierte oder verhinderte Carnosinsäure (5 µM) den DrVSP-induzierten KCNQ3*-Stromabfall unter ähnlichen Bedingungen (Abb. 5e, f; Ergänzungstabelle 5). Interessanterweise haben wir zuvor beobachtet, dass die GABA-Bindung KCNQ2/3-Kanäle nach einer Vorbehandlung mit Wortmannin öffnen kann26.

a Mittlere Spuren für KCNQ3*, exprimiert in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von Carnosinsäure (5 µM), mit oder ohne Wortmannin-Vorbehandlung zur Abreicherung von PIP2. Maßstabsbalken unten links für jede Spur; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 5–9 pro Gruppe. b Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ3*-Spuren wie in a; n = 5–9 pro Gruppe. c Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für KCNQ3*-exprimierende Oozyten wie in a; n = 5–9 pro Gruppe. d ΔV0.5act, induziert durch Carnosinsäure (5 µM) für KCNQ3*, exprimiert in Eizellen wie in (a), in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (lila) einer Wortmannin-Vorbehandlung; n = 5–9 pro Gruppe. e Mittlere Spuren für KCNQ3*, das in Eizellen mit DrVSP in Abwesenheit (schwarz; Kontrolle) oder Anwesenheit (rot) von Carnosinsäure (5 µM) koexprimiert wird, gepulst auf +120 mV, um VSP zu aktivieren und PIP2 zu dezimieren; Spannungsprotokoll, oberer Einschub; n = 5. f Mittlerer Stromabfall für den Zeitraum zwischen den Pfeilen in Feld e für KCNQ3* in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit (CA) von Carnosinsäure (5 µM); n = 5. Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an. Statistische Vergleiche mittels T-Test oder einfaktorieller ANOVA.

Von den anderen getesteten Rosmarinverbindungen (Abb. 6a) öffnete nur Hesperidin KCNQ2/3-Kanäle (–10,4 mV V0,5act-Verschiebung bei 30 µM) (Abb. 6b–d) und hyperpolarisierte die EM von KCNQ2/3-exprimierenden Eizellen ( Abb. 6e), Hesperidin öffnete KCNQ2 jedoch nicht (Abb. 6f – i; Ergänzungstabelle 6), was darauf hinweist, dass im Gegensatz zu Carnosinsäure die Wirkung von Hesperidin auf KCNQ3* (Abb. 3) in KCNQ2/3-Komplexen dominant ist. Die schwache Öffnungswirkung von Hesperidin und Carnosinsäure liegt wahrscheinlich der schwachen KCNQ2/3-Öffnungsfähigkeit von Rosmarinextrakt zugrunde.

a Jmol-Diagramme der Struktur (oben) und der Oberflächenladung (unten) für Rosmarinverbindungen wie angegeben. b Mittlere Spuren für KCNQ2/3-Heteromere, die in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von 30 oder 100 µM Rosmarinverbindungen (rot) exprimiert werden, wie angegeben. Maßstabsbalken unten links; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 4-5 pro Gruppe. c Mittlerer Schwanzstrom für KCNQ2/3-Spuren wie in (b); n = 4–5 pro Gruppe. d Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ2/3-Spuren wie in (b); n = 4-5 pro Gruppe. e Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für KCNQ2/3-exprimierende Oozyten wie in b; n = 4–5 pro Gruppe. (f) Mittlere Spuren für KCNQ2-Homere, die in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von 30 µM Hesperidin (rot) exprimiert werden. Maßstabsbalken unten links; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 4 pro Gruppe. (g) Mittlerer Schwanzstrom für KCNQ2-Spuren wie in (f); n = 4 pro Gruppe. (h) Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ2-Spuren wie in (f); n = 4 pro Gruppe. i Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für KCNQ2-exprimierende Oozyten wie in (f); n = 4 pro Gruppe. Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an. Statistische Vergleiche mittels einfaktorieller ANOVA.

Carnosinsäure aktivierte auch KCNQ5 und induzierte eine relativ kleine (–7,2 mV) Verschiebung von V0,5act (bei 100 µM), aber noch bemerkenswerter ist eine Komponente (~ 5 %) des konstitutiv aktivierten Stroms selbst bei –120 mV (Abb. 7a). -C). Bemerkenswerterweise war Carnosinsäure (100 µM) ein starker Öffner von heteromeren KCNQ3/5-Kanälen und überwand auch die relative Unempfindlichkeit von KCNQ2, die die Reaktion von KCNQ2/3-Heteromeren (Abb. 4) dominierte, um die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung von negativ zu verschieben KCNQ2/5- und KCNQ2/3/5-Heteromere, von denen beide wie KCNQ3/5 vermutlich zum neuronalen M-Strom beitragen5 (Abb. 7a–c). Dementsprechend hyperpolarisierte Carnosinsäure EM in Eizellen, die KCNQ5-haltige Homomere und Heteromere exprimierten (Abb. 7d). Carnosinsäure-Dosis-Wirkungs-Studien ergaben, dass die Auswirkungen auf KCNQ3/5 zwischen denen auf KCNQ3- und KCNQ5-Homere lagen (Abb. 7e, f), ebenso wie die Auswirkungen auf KCNQ2/5 und KCNQ2/3/5 (Abb. 7g, h) ( Ergänzungstabelle 7). Daher liegt wahrscheinlich Carnosinsäure der KCNQ3/5-Öffnungsfähigkeit von Rosmarinextrakt zugrunde (Abb. 2i – l).

a Mittlere Spuren für neuronale KCNQ5-haltige Homomere und Heteromere, wie angegeben, ausgedrückt in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von Carnosinsäure (100 µM) (rot). Maßstabsbalken unten links; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 5 pro Gruppe. b Mittlerer Schweifstrom für Kanäle wie in Tafel a; n = 5 pro Gruppe. c Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für Kanäle wie in Tafel a; n = 5 pro Gruppe. d Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für Oozyten, die Kanäle exprimieren, wie in Bild A; n = 5 pro Gruppe. e Mittelwert ΔV0,5act gegenüber [Carnosinsäure] für die angegebenen Kanäle; n = 5 pro Gruppe; KCNQ3*-Daten aus Abb. 4C zum Vergleich. F. Mittleres ΔEM gegenüber [Carnosinsäure] für nicht abgeklemmte Eizellen, die wie angegeben Kanäle exprimieren; n = 5 pro Gruppe. KCNQ3*-Daten zum Vergleich aus Abb. 4D berechnet. g Mittelwert ΔV0,5act gegenüber [Carnosinsäure] für die angegebenen Kanäle; n = 5 pro Gruppe; KCNQ2-, KCNQ3- und KCNQ2/3*-Daten aus Abb. 4 zum Vergleich enthalten. h Mittleres ΔEM gegenüber [Carnosinsäure] für nicht abgeklemmte Eizellen, die wie angegeben Kanäle exprimieren; n = 5 pro Gruppe. KCNQ2-, KCNQ3*- und KCNQ2/3-Daten aus Abb. 4 zum Vergleich enthalten. Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an. Statistische Vergleiche mittels T-Test oder einfaktorieller ANOVA.

Aufgrund der starken Öffnungswirkung von Carnosinsäure auf KCNQ3- und KCNQ3/5-Kanäle und unserer früheren Erkenntnisse über Synergien zwischen kleinen Molekülen, die bevorzugt auf verschiedene Isoformen in KCNQ-Heteromeren abzielen12, haben wir die Kombination von Carnosinsäure und dem KCNQ5-selektiven Öffner Aloperin getestet15 (Abb. 8a) auf KCNQ3/5. Aloperin (5 µM) war ein schwacher KCNQ3/5-Öffner, während die anschließende Zugabe von Carnosinsäure (5 µM) in Gegenwart von Aloperin paradoxerweise den Öffnungseffekt (Abb. 8b, c) und die Fähigkeit, eine KCNQ3/5-Hyperpolarisation zu induzieren, weiter abschwächte von EM (Abb. 8d; Ergänzungstabelle 8). Dies deutete auf eine sterische Hinderung zwischen den beiden kleinen Molekülen hin, was mit einer ähnlichen Interaktionsstelle für die beiden übereinstimmt. Wir haben zuvor herausgefunden, dass Aloperin im KCNQ5-S4-5-Linker15 nahe an R212 bindet. Hier ist Carnosinsäure in Silico nahe an das Äquivalent Arginin und seinen Nachbarn an der kryo-EM-abgeleiteten Struktur von menschlichem KCNQ2 (R213, R214)27 und an das AlphaFold28,29-Modell von menschlichem KCNQ3 (R242, R243) angedockt (Abb . 8e). Interessanterweise sagte das In-silico-Docking die Bildung einer Ionenbindung zwischen Carnosinsäure über ihre Carboxylatgruppe und der Guanidiniumgruppe von R243 in KCNQ3 voraus, nicht jedoch in KCNQ2 (Abb. 8e; Nahaufnahme in Abb. 8f). Wir verstehen noch nicht, welchen Einfluss die KCNQ3- und KCNQ2-Umgebung um R243 auf diesen vorhergesagten Unterschied in der Wechselwirkung mit Carnosinsäure hat.

a Struktur von Aloperin. b Mittlere Spuren für KCNQ3/5, exprimiert in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von Aloperin und/oder Carnosinsäure (5 µM). Maßstabsbalken unten links; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 5 pro Gruppe. c Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ3/5, Pharmakologie wie in Panel B; n = 5 pro Gruppe. d Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für Oozyten, die KCNQ3/5 exprimieren; Pharmakologie wie in (b); n = 5 pro Gruppe. e. In-silico-Docking-Ergebnisse für Aloperin in einem KCNQ5-Modell; Carnosinsäure in einer KCNQ2-Kryo-EM-abgeleiteten Struktur56,57 und in einem KCNQ3-AlphaFold-Modell. f Nahaufnahme des Andockens von Carnosinsäure an die KCNQ3-Modellstruktur, die die vorhergesagte Ionenbindung zwischen der Carnosinsäure-Carboxylgruppe und der R243-Guanidiniumgruppe (grün) zeigt. g Mittlere Spuren für mutiertes (wie angegeben) KCNQ3*, das in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von Carnosinsäure (100 µM) exprimiert wird. Maßstabsbalken unten links; Spannungsprotokoll wie in (b); n = 4–10 pro Gruppe. h Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ3*-Mutanten in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Carnosinsäure; n = 4–10 pro Gruppe. N / a nicht anwendbar. i Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für Oozyten, die KCNQ3*-Mutanten exprimieren, in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Carnosinsäure; n = 4–10 pro Gruppe. N / a nicht anwendbar. j Mittelwert ΔV0,5act gegenüber [Carnosinsäure] für R242A KCNQ3*; n = 4–10 pro Gruppe; Wildtyp-KCNQ3*-Daten aus Abb. 4 zum Vergleich. k Mittleres ΔEM gegenüber [Carnosinsäure] für R242A KCNQ3*; n = 4–10 pro Gruppe; Wildtyp-KCNQ3*-Daten aus Abb. 4 zum Vergleich. Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an. Statistische Vergleiche mittels einfaktorieller ANOVA und gepaartem t-Test.

Um die Vorhersagen zu testen, führten wir zunächst eine Alanin-Scanning-Mutagenese von KCNQ3-R242, R243 und benachbarten Resten durch und stellten fest, dass die Mutation von R242 oder R243 die Wirkung von Carnosinsäure (100 µM) stark verringerte, insbesondere die Fähigkeit, KCNQ3* zu öffnen stark hyperpolarisierte Potentiale (Abb. 8g, h; Ergänzungstabelle 8; zum Vergleich der Mutanten- gegenüber der Wildtyp-Grundspannungsabhängigkeit siehe ergänzende Abb. 1), obwohl Carnosinsäure die Fähigkeit zur EM-Hyperpolarisierung beibehielt, da dies bei weniger hyperpolarisierten Potentialen auftritt (Abb . 8i). Eine Dosis-Wirkungs-Studie zeigte, dass die R242A-Mutation die Wirksamkeit von Carnosinsäure in Bezug auf ΔV0,5act halbierte (Abb. 8j), während wir die Dosis-Wirkungs-Beziehung für die ΔEM-Verschiebung nicht eindeutig interpretieren konnten, da sie bei nicht gesättigt war die höchstmögliche Carnosinsäure-Dosis (Abb. 8k).

Interessanterweise führte die Mutation von R239 oder D241 zu Alanin zu nicht funktionierenden Kanälen, was auf die Bedeutung dieser Reste für die Kanalaktivierung oder möglicherweise die Proteinfaltung schließen lässt. KCNQ3*-M240A hatte im Vergleich zu KCNQ3* eine positiv verschobene Spannungsabhängigkeit der Aktivierung, wurde jedoch durch Carnosinsäure (100 µM) immer noch stark geöffnet, mit 20 % konstitutivem Strom bei –120 mV. KCNQ3*-G244A verhielt sich sowohl hinsichtlich der Grundaktivität als auch hinsichtlich der Wirkung von Carnosinsäure nicht von KCNQ3*. Die mittlere Spannungsabhängigkeit der Aktivierung von KCNQ3*-G245A war im Vergleich zu KCNQ3* um –32 mV verschoben, zeigte jedoch immer noch eine robuste Empfindlichkeit gegenüber Carnosinsäure (–45 mV Verschiebung der mittleren Spannungsabhängigkeit der Aktivierung mit 100 µM Carnosinsäure (Abb. 8g, h; Ergänzung). Tabelle 8).

Als nächstes testeten wir die Auswirkungen von mutiertem KCNQ3-W265 auf die Öffnung von Carnosinsäure, einem für die Retigabin- und GABA-Bindung an KCNQ326,30,31 essentiellen Rest, sowie von P211 und L198, Resten, die von anderen als wichtig für die Bestimmung der unterschiedlichen Selektivität von ICA069673 für KCNQ2 identifiziert wurden gegen KCNQ332. Carnosinsäure zeigte eine ähnliche Öffnungswirksamkeit für KCNQ3*- und KCNQ3*-W265L-Kanäle, obwohl letzterer hinsichtlich der Wirksamkeit etwa fünfmal empfindlicher war (Abb. 9a–c). Die Kanäle KCNQ3*-P211A und KCNQ3*-L198F verhielten sich hinsichtlich der Wirksamkeit und Wirksamkeit von Carnosinsäure sehr ähnlich wie KCNQ3* (Abb. 9a–c).

a Mittlere Spuren für Wildtyp- und mutierte KCNQ3*-Kanäle, wie angegeben in Abwesenheit (Kontrolle) und Anwesenheit von Carnosinsäure (100 µM), n = 4 für L198F, 5 für andere. b Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) gegenüber der Spannung für Spuren wie in (a), n = 4 für L198F, 5 für andere. c Mittelwert ΔV0,5act gegenüber [Carnosinsäure] für KCNQ3*-Mutanten wie angegeben; n = 4 für L198F, 5 für andere; Wildtyp-KCNQ3*-Daten aus Abb. 4 zum Vergleich. d Mittelwert ΔV0.5act für Wildtyp- und mutierte KCNQ3*-Kanäle; n = 4 für L198F, 5–10 pro Gruppe für andere; NF nicht funktionsfähig. Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an. Statistische Vergleiche mittels einfaktorieller ANOVA. Spannungsprotokoll wie in Abb. 8.

Der Vergleich der Verschiebungen in V0.5act, R242A und R243A reduzierte die Wirksamkeit von Carnosinsäure am stärksten, gefolgt von einer Mutation eines der drei proximalen Reste (M240A, G244A, G245A) (Abb. 9d; Ergänzungstabelle 9). Insgesamt deuten die Daten stark darauf hin, dass KCNQ3 R242 und R243 wichtige Komponenten der Carnosinsäure-Interaktion und/oder ihrer funktionellen Wirkungen sind.

Die In-silico-Docking- und In-vitro-Mutagenesestudien (Abb. 8 und 9) legen nahe, dass die Aktivierung von KCNQ3* durch Carnosinsäure durch die ionische Bindung zwischen der Carboxylatgruppe an Carnosinsäure und der Guanidiniumgruppe an KCNQ3*-R243 erleichtert wird (Abb. 10a, B). Als nächstes haben wir in silico Carnosinsäure an die Mutante KCNQ3 (R242A und/oder R243A) angedockt und festgestellt, dass die Einzelmutationen die vorhergesagte freie Bindungsenergie (ΔG) verringerten und dass sie durch die Doppelmutation weiter verringert wurde; R243A- und R242A-, R243A-Mutationen beseitigten auch die oben beschriebene vorhergesagte Bildung ionischer Bindungen (Abb. 10b). Um die Bedeutung dieser Wechselwirkungen weiter zu testen, haben wir mehrere mit Carnosinsäure verwandte Verbindungen synthetisiert und auf ihre KCNQ-Öffnungsaktivität getestet. Carnosinsäure weist ein negatives elektrostatisches Oberflächenpotential auf, das auf der Carboxylatgruppe zentriert ist und voraussichtlich die Bindung an KCNQ3 erleichtert (Abb. 10c). Carnosol, das auch in Rosmarin vorkommt21, weist keine Carboxylatgruppe auf, die in Carnosolsäure vorhanden ist, weist jedoch das vorhergesagte negative elektrostatische Oberflächenpotential auf derselben Seite des Moleküls wie Carnosolsäure auf, jedoch nicht genau an derselben Stelle, und dem steht das vorhergesagte positive Potential auf der gegenüber distale Seite des Moleküls (Abb. 10c). Es wurde daher nicht vorhergesagt, dass Carnosol eine ionische Bindung an die R243-Guanidiniumgruppe bildet (Abb. 10d) und bei 100 µM nur eine schwache negative Verschiebung von –11 mV in KCNQ3* V0.5act erzeugte (verglichen mit einer negativen Verschiebung von –62 mV für). Carnosinsäure bei 100 µM; Abb. 3c, d) und keine Verschiebung für KCNQ2 oder KCNQ2/3 (Abb. 10e, f). Ebenso veränderte Carnosol die EM von Eizellen, die KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3 exprimierten, nicht (Abb. 10g). Als nächstes fügten wir dem Carnosol zwei Methylgruppen hinzu, wodurch Dimethylcarnosol entstand, dessen Oberflächenladungsprofil dem von Carnosolsäure etwas ähnlicher ist (Abb. 10c), aber keine ionische Bindung zu R243 eingehen kann (Abb. 10d) und nur induziert wird eine hyperpolarisierende Verschiebung von –3,2 mV in KCNQ3* V0.5act (Abb. 10e, f), obwohl EM um > 8 mV hyperpolarisiert werden konnte (Abb. 10g).

a Struktur der Carnosinsäure mit Hervorhebung der Carboxylgruppe. b In-silico-Andocken von Carnosinsäure an Wildtyp- und mutierte KCNQ3-Modelle. c Strukturen und elektrostatische Oberflächenpotentiale (rot, negativ; blau, positiv) von Carnosinsäure und Derivaten wie angegeben. d In-silico-Andocken von Carnosinsäure und Derivaten an das Wildtyp-KCNQ3-Modell. e Mittlere Spuren für KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3, exprimiert in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von Carnosinsäurederivaten (100 µM). Maßstabsbalken unten links; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 4–10 pro Gruppe. f Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3 in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Verbindungen wie in (e); n = 4–10 pro Gruppe. g Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für Oozyten, die KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3 exprimieren, in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Verbindungen wie in (e); n = 4–10 pro Gruppe; DMC-Dimethylcarnosol. h Strukturen und elektrostatische Oberflächenpotentiale (rot, negativ; blau, positiv) von Carnosinsäurederivaten wie angegeben. i In-silico-Docking von Carnosinsäure-Derivaten an das Wildtyp-KCNQ3-Modell. j Mittlere Spuren für KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3, exprimiert in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von Carnosinsäure-γ-lacton (10 µM). Maßstabsbalken unten links; Spannungsprotokoll wie in (b); n = 5–10 pro Gruppe. k Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3 in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Carnosinsäure-γ-lacton (10 µM); n = 5–10 pro Gruppe. l Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für Oozyten, die KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3 exprimieren, in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Carnosinsäure-γ-lacton (CAγL) (10 µM); n = 5–10 pro Gruppe. m Mittlere Spuren für KCNQ3* oder KCNQ2/3, exprimiert in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von Methylcarnosat (100 µM). Maßstabsbalken unten links; Spannungsprotokoll wie in Panel e; n = 5–10 pro Gruppe. n Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ3* oder KCNQ2/3 in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Methylcarnosat (100 µM); n = 5–10 pro Gruppe. o Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für Oozyten, die KCNQ3* oder KCNQ2/3 exprimieren, in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Methylcarnosat (100 µM); n = 5–10 pro Gruppe. MC-Methylcarnosat. p Strukturen und elektrostatische Oberflächenpotentiale (rot, negativ; blau, positiv) von Carnosinsäurederivaten wie angegeben. q In-silico-Docking von Carnosinsäure-Derivaten an das Wildtyp-KCNQ3-Modell. r Mittlere Spuren für KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3, exprimiert in Eizellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von Carnosinsäurederivaten (10–100 µM). Maßstabsbalken unten links; Oberer Einschub des Spannungsprotokolls; n = 10 pro Gruppe. s Mittlerer normalisierter Schwanzstrom (G/Gmax) für KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3 in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Verbindungen wie in (r); n = 10 pro Gruppe. t Mittleres ungeklemmtes Oozytenmembranpotential für Oozyten, die KCNQ2, KCNQ3* oder KCNQ2/3 exprimieren, in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit (rot) von Verbindungen wie in (r); n = 10 pro Gruppe; CAD Carnosinsäurediacetat; PA Pisiferinsäure. u Mittlerer ΔV0,5act für KCNQ3* als Reaktion auf Carnosinsäure und Derivate; n = 5–10 pro Gruppe. v Mittelwert ΔV0,5act für KCNQ2/3 als Reaktion auf Carnosinsäure und Derivate; n = 5–10 pro Gruppe. Zum Vergleich dargestellte KCNQ3*-Reaktion auf Carnosinsäure (grau; aus (u)). Fehlerbalken zeigen SEM an. n gibt die Anzahl biologisch unabhängiger Eizellen an. Statistische Vergleiche mittels einfaktorieller ANOVA.

Als nächstes synthetisierten wir Carnosinsäure-γ-lacton, das keine Carboxylatgruppe enthält, aber voraussichtlich über eine Phenolgruppe am anderen Ende des Moleküls eine H-Bindung an R243 eingeht (Abb. 10h, i). Interessanterweise war Carnosinsäure-γ-Lacton in der Lage, die V0,5act von KCNQ3* und KCNQ2/3 zu hyperpolarisieren, wenn auch sehr schwach (−8,7 bzw. −10 mV) (Abb. 10j, k) und ohne EM zu hyperpolarisieren (Abb . 10l) (beachten Sie, dass wir es aufgrund von Löslichkeitsproblemen nur bei 10 µM testen konnten). In ähnlicher Weise wurde nicht vorhergesagt, dass Methylcarnosat, bei dem wir die Carnosinsäure-Carboxylatgruppe durch eine Methylestergruppe ersetzt haben (Abb. 10h), eine ionische Bindung zu Arginin in KCNQ3 bildet (Abb. 10i), sondern nur ein schwacher Aktivator von KCNQ3* und öffnete KCNQ2/3 nicht, obwohl wir aufgrund der schlechten Löslichkeit nur bei 10 µM testen konnten (Abb. 10m–o).

Schließlich konzentrierten wir uns auf Carnosinsäurederivate, die die Carnosinsäure-Carboxylatgruppe und ihre vorhergesagte negative elektrostatische Oberflächenpotentialposition beibehielten, aber aufgrund ihrer veränderten Strukturen auch ein positives elektrostatisches Oberflächenpotential am entgegengesetzten Ende des Moleküls zur Carboxylatgruppe aufwiesen. Somit hatte Pisiferinsäure eine vorhergesagte freie Bindungsenergie an die KCNQ3-S4/5-Arginine, die der von Carnosinsäure sehr ähnlich war (jeweils −8,1 gegenüber −8,2 kcal/mol), hatte jedoch eine andere vorhergesagte Bindungsorientierung als die von Carnosinsäure fehlte die vorhergesagte Ionenbindung (Abb. 10p, q) und verschob die Spannungsabhängigkeit von KCNQ3* bei 100 µM nur schwach negativ (Abb. 10r – t). Carnosinsäurediacetat hatte ein ähnliches vorhergesagtes elektrostatisches Oberflächenpotentialgleichgewicht wie Pisiferinsäure (Abb. 10p), nahm eine ähnliche vorhergesagte, nichtionische Bindungsorientierung relativ zu den KCNQ3-Argininen an wie Pisiferinsäure (Abb. 10q) und nur schwach hat die Spannungsabhängigkeit von KCNQ3* oder KCNQ2/3 negativ verschoben (beachten Sie, dass wir es aufgrund von Löslichkeitsproblemen nur bei 10 µM testen konnten) (Abb. 10r – t). Zusammenfassend ist Carnosinsäure eine Goldlöckchen-Verbindung in diesem chemischen Bereich mit einer essentiellen Carboxylatgruppe und einem Ladungsgleichgewicht, das für die KCNQ3*-Öffnung äußerst optimal ist (Abb. 10u, v; Ergänzungstabelle 10).

Rosmarin ist eine reichhaltige Quelle an Flavonolen, Phenolsäuren, Terpenoiden und ätherischen Ölen21 und wird traditionell medizinisch bei einer Vielzahl von Erkrankungen eingesetzt, die von Krebs über Magen-Darm-Probleme bis hin zu Gedächtnisverlust reichen, und ist aufgrund seines Geschmacks in der Küche weit verbreitet die Welt17,33. Der Name Rosmarin leitet sich vom lateinischen Wort „Tau des Meeres“ (ros marinus) ab, da er an den Küstenklippen des Mittelmeers und Asiens heimisch ist; Sein Verbreitungsgebiet reicht mittlerweile bis nach Amerika, England und Nordafrika. Rosmarin wurde im antiken Griechenland, Rom, Israel und Ägypten wegen seiner angeblich wohltuenden Wirkung gegen Gedächtnisverlust, Muskelschmerzen, Infektionen und Magen-Darm-Störungen verehrt. Man geht davon aus, dass die Römer es auf den Britischen Inseln eingeführt haben, wo es bereits seit dem 13. Jahrhundert von den keltischen Druiden gegen Indikationen wie Kopfschmerzen eingesetzt wurde, und es ist möglich, dass es schon vorher in Südengland angebaut wurde die Römer kamen17,33.

Es gibt so viele angebliche medizinische Anwendungen von Rosmarin, dass man leicht skeptisch gegenüber der Wirksamkeit sein kann, aber zumindest ein Teil der therapeutischen Wirkungen wurde durch präklinische oder klinische Studien gestützt, darunter neurologische Vorteile im Bereich Gedächtnis, Analgesie, Angstzustände und Depressionen , Epilepsie, Linderung von Opiumentzugssymptomen und Schlaf; und antimikrobielle, entzündungshemmende und antioxidative Eigenschaften17,34,35. Rosmarinsäure und Carnosinsäure sind die Rosmarinphenole, die am häufigsten mit positiven Wirkungen in Verbindung gebracht werden, was größtenteils auf ihre antioxidativen und entzündungshemmenden Wirkungen zurückgeführt wird34. Zuvor wurde festgestellt, dass Rosmarinextrakt und Rosmarinsäure den spannungsgesteuerten Kalziumkanal Cav3.2 (IC50 von 49,9 µM Rosmarinsäure) hemmen. Die Autoren schlugen vor, dass die Hemmung von Cav3.2 zu den anxiolytischen und neuroprotektiven Eigenschaften von Rosmarin beitragen könnte36. In Verbindung mit unseren neuen Erkenntnissen deuten die kombinierten Daten darauf hin, dass Rosmarin aufgrund der komplementären Wirkung zweier seiner Bestandteile (Rosmarinsäure und Carnosinsäure) auf Cav- bzw. Kv-Ströme als Neurotherapeutikum besonders wirksam sein könnte. Darüber hinaus wurde zuvor berichtet, dass Carnosinsäure in vitro die Bindungsaffinität von [35S]tert-Butylbicyclophosphorothionat an Rattenhirnmembranen verringert, was als Beweis für die Bindung an einen GABAA-Rezeptor angesehen wird, es wurden jedoch keine funktionellen Studien gemeldet37. Carnosinsäure wird in vivo äußerst gut vertragen. Studien zur akuten Toxizität an Mäusen weisen auf eine orale LD50 von 7,1 g/kg hin38.

Die Wirksamkeit und Wirksamkeit von Carnosinsäure (z. B. –25 mV-Verschiebung in V0,5 der KCNQ3/5-Aktivierung bei 30 µM und EC50 von 4,53 ± 0,11 µM; Ergänzungstabelle 7) konkurrieren mit der synthetischen First-in-Class KCNQ-Kanalöffnungs-Antikonvulsivum, Retigabin (Ezogabin) (–31,8 mV Verschiebung in V0,5 der KCNQ3/5-Aktivierung bei 30 µM und EC50 von 1,4 µM)20. Der Unterschied zwischen den beiden besteht darin, dass Retigabin zwar KCNQ3 bevorzugt, aber immer noch ein hochwirksamer KCNQ2- und insbesondere KCNQ2/3-Kanalöffner ist und ihm daher die KCNQ-Isoform- und KCNQ-Heteromerselektivität von Carnosinsäure fehlt39. Dies verleiht Carnosinsäure ein einzigartiges Potenzial als Sonde und potenziell therapeutischer Öffner neuronaler KCNQ3/5-Kanäle im Vergleich zu den wesentlich besser untersuchten und besser verstandenen KCNQ2/3-Kanälen.

Kürzlich wurde festgestellt, dass das Bakterizid Triclosan KCNQ3, aber nicht KCNQ2 aktiviert, und zwar auch durch Hyperpolarisierung der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung über eine vorhergesagte Bindungsstelle oben am Spannungssensor, ähnlich dem, was wir zuvor für Quercetin mit KCNQ140 gefunden haben. Triclosan aktiviert jedoch auch KCNQ2/3-Kanäle (EC50 von 32 µM)40. Triclosan ist mit verschiedenen Gesundheits- und Umweltkontaminationsrisiken verbunden, was es als potenziellen therapeutischen KCNQ-Kanalmodulator nicht gerade ideal macht41, aber es bleibt dennoch eine zusätzliche und potenziell nützliche M-Stromsonde. Auswirkungen von Triclosan auf andere KCNQ-Homere und -Heteromere wurden nicht beschrieben.

Mithilfe medizinischer Chemie, Mutagenese und In-silico-Docking konnten wir mehrere Merkmale der KCNQ3*-Öffnungswirkung von Carnosinsäure eingrenzen. Erstens scheint Carnosinsäure in diesem chemischen Bereich nahezu voroptimiert zu sein, dh keine der zahlreichen durchgeführten chemischen Modifikationen wurde im Hinblick auf die Fähigkeit, KCNQ3* zu öffnen, toleriert; Die Änderungen machten es auch nicht möglich, KCNQ2 oder KCNQ2/3 im Wesentlichen zu öffnen. Zweitens scheint die Carnosinsäure-Carboxylatgruppe für die hochwirksame Öffnung von KCNQ3* über die Bildung einer Ionenbindung mit der Guanidiniumgruppe von KCNQ3*-R243 wesentlich zu sein. Drittens reicht es nicht aus, an einer ähnlichen Stelle ein noch stärkeres und fokussierteres elektrostatisches Oberflächenpotential zu erzeugen, aber die chemische Ersetzung der Carboxylatgruppe durch einen Ester (z. B. Methylester von Carnosinsäure) zu verwenden, um eine robuste KCNQ3*-Öffnung zu induzieren (Abb. 10). Weitere medizinische Chemie könnte genutzt werden, um ein bevorzugtes pharmakokinetisches/pharmakodynamisches Profil für die zukünftige Arzneimittelentwicklung bereitzustellen. Es ist zu beachten, dass die vorhergesagten Werte der freien Bindungsenergie (ΔG) im Vergleich zu denen der Carnosinsäure-Bindung an KCNQ3* für Carnosinsäure-Derivate, die an KCNQ3* binden, oder für Carnosinsäure-Bindung an KCNQ3*-R242A oder KCNA3*- niedriger waren. R243A, aber nicht dramatisch niedriger (Abb. 10). Ob diese vorhergesagte Verringerung von ΔG eine Verringerung der Bindungsaffinität widerspiegelt, die ausreicht, um die verringerten funktionellen Effekte zu erklären, im Vergleich zu einer moderaten Verringerung der Bindungsaffinität gepaart mit einer geringeren Fähigkeit gebundener Carnosinsäure und Derivate, die Kanalöffnung bei diesen Mutanten zu betätigen, bleibt eindeutig verifiziert. Es ist bereits bekannt, dass Carnosinsäure die Blut-Hirn-Schranke passiert und neuroprotektiv wirkt; letztere Eigenschaft wurde früher der Aktivierung antioxidativer Enzyme über den Nrf2-Transkriptionsweg zugeschrieben; Es wurde auch festgestellt, dass Carnosinsäure vor Netzhautdegeneration und oxidativem Stress schützt42. KCNQ5-Transkript und -Protein finden sich im retinalen Pigmentepithel, wo es vermutlich zum dort exprimierten M-Strom beiträgt43.

Wir fanden heraus, dass die Öffnung von KCNQ3* durch Carnosinsäure wie Retigabin und GABA resistent gegen die Reduktion von PIP2 ist, einem aus Lipiden abgeleiteten Signalmolekül, das die Aktivierung des Spannungssensors mit der Kanalöffnung in KCNQ-Kanälen koppelt44. Es gibt mindestens zwei Interpretationen dieses Ergebnisses. Das erste ist, dass Carnosinsäure PIP2 ersetzt oder überflüssig macht und dass Carnosinsäure unabhängig von der Anwesenheit von PIP2 ihre Öffnungsfähigkeit beibehält. Die alternative Erklärung ist, dass Carnosinsäure die PIP2-Bindung an den Kanal stabilisiert, aber möglicherweise immer noch PIP2 benötigt, damit Carnosinsäure KCNQ3 öffnet, wie zuvor für Retigabin22 vorgeschlagen. Hier wurde durch die Vorbehandlung mit Wortmannin zur Reduzierung der PIP2-Spiegel vor der Zugabe von Carnosinsäure die Wirksamkeit von Carnosinsäure bei ihrem KCNQ3* EC50 (5 µM) um einen statistisch signifikanten, aber moderaten Grad verringert, was keines der beiden Modelle eindeutig stützt. Carnosinsäure (5 µM) konnte im Durchschnitt den KCNQ3*-Stromabfall über 15 s durch Aktivierung von DrVSP bei +120 mV verhindern, um PIP2 abzubauen, was in Abwesenheit von Carnosinsäure zu einem Stromverlust von 50 % führte. Auch dies unterstützt keines der beiden Modelle eindeutig, und wir haben noch nicht genügend Beweise, um eines der beiden Modelle gegenüber dem anderen zu bevorzugen. Es gibt einen Präzedenzfall für ein PIP2-Ersatzmodell, nämlich CP1, den synthetischen, sulfathaltigen PIP2-Ersatz, der durch In-silico-Docking-Screening an KCNQ145 entdeckt wurde. Interessanterweise ist Carnosinsäure ähnlich wie PIP2 ein amphipathisches Molekül – Carnosinsäure enthält eine polare Carbonsäure und Phenolgruppen sowie ein unpolares Diterpengerüst. Wir halten es für wahrscheinlich, dass seine Affinität für KCNQ3 eine Funktion sowohl ionischer, Wasserstoffbrücken- als auch hydrophober Wechselwirkungen ist.

Interessanterweise gibt nichts in der vorhergesagten KCNQ3-Bindungsregion von Carnosinsäure Hinweise auf den Mechanismus ihrer Selektivität, und ungewöhnlicherweise ist die KCNQ3*-W265L-Mutante im Gegensatz zu Retigabin und GABA mindestens so empfindlich gegenüber Carnosinsäure wie KCNQ3*. Wir interpretieren diese Ergebnisse als Beweis dafür, dass Carnosinsäure wie CP1 tief in der Bindungstasche zwischen Pore und VSD bindet, im Gegensatz zu Retigabin und GABA, die näher an W26526,30,31 binden. Im Gegensatz zu CP145 öffnet Carnosinsäure das homomere KCNQ1 nicht. Im Hinblick auf die V0.5act-Hyperpolarisation ist CP1 auf KCNQ1/KCNE1 am aktivsten, gefolgt von KCNQ1 und KCNQ3* und dann KCNQ226,30,31 (KCNQ5-Daten werden nicht gemeldet); Carnosinsäure ist bei KCNQ3* am aktivsten, gefolgt von KCNQ5, mit vernachlässigbaren Auswirkungen auf KCNQ1 oder KCNQ2. Ähnlich wie GABA, von dem wir fanden, dass es physisch an KCNQ2–5 bindet (über S5 Trp, W265 im menschlichen KCNQ3), aber nur KCNQ3* und KCNQ526 aktiviert, stimmen unsere aktuellen Daten damit überein, dass die Carnosinsäure-Selektivität funktionell ist (d. h. die Bindung öffnet etwas KCNQ). Isoformen, aber nicht andere) und nicht aus seiner Bindungsfähigkeit per se resultieren. Weitere Studien sind erforderlich, um zu verstehen, was diese funktionelle Selektivität verleiht.

Interessanterweise wurde zuvor berichtet, dass für eine nahezu maximale Retigabin-Empfindlichkeit zwar das Vorhandensein nur einer Retigabin-empfindlichen Untereinheit erforderlich ist, die Wirkung von ICA73, von dem man annimmt, dass es mit dem KCNQ3*-Spannungssensor interagiert, jedoch hochempfindlich auf die Mutation auch nur einer einzigen Untereinheit reagiert Untereinheit im Tetramer46. Diese Empfindlichkeit könnte der Grund dafür sein, dass die KCNQ-Isoformselektivität gegenüber kleinen Molekülen, die auf die Spannungssensordomäne abzielen, höher ist als bei dem weniger KCNQ-selektiven Retigabin. Das genaue molekulare Korrelat dieser Selektivität muss nicht unbedingt im VSD vorliegen; Wie oben erläutert, kann die Bindung zwar im VSD erfolgen, die Umwandlung dieser Bindung in eine verstärkte Aktivierung könnte jedoch von anderen Segmenten abhängen. Die größte Abweichung zwischen KCNQ3 und anderen neuronalen Isoformen liegt zwischen S5 und dem Selektivitätsfilter, wo KCNQ3 zehn zusätzliche Reste enthält, aber es gibt auch sporadische Sequenzunterschiede in den Transmembransegmenten für zukünftige Untersuchungen47.

Es ist wichtig zu beachten, dass eine Einschränkung der Studie darin besteht, dass wir die relative Expression des Proteins jeder KCNQ-Isoform bei der Coexpression mehrerer Untereinheiten nicht überprüft haben. Eizellen sind Säugetierzellen für transiente Expressionsstudien mit mehreren Untereinheiten überlegen, da jeder Eizelle unabhängig cRNA für jede Untereinheit injiziert wird, im Gegensatz zur Transfektion einer Population von Säugetierzellen, die eher zu einer höheren Variabilität des relativen Anteils der Untereinheiten führt eine bestimmte Zelle. Dennoch ist es möglich, dass es in einer bestimmten Eizelle eine Variabilität in der relativen Isoform-Expression gab, und dies könnte zu einer bescheidenen Variabilität in der Mittelpunktspannungsabhängigkeit der Aktivierung und der Aktivierungsrate zwischen Kontrollgruppen für eine gegebene Untereinheitenkombination beigetragen haben. Weitere Variabilitätsquellen könnten auch Temperaturschwankungen oder Unterschiede im PIP2-Spiegel oder anderen Eizellenfaktoren zwischen verschiedenen Gruppen sein, da die Aufzeichnungen über viele Monate hinweg durchgeführt wurden. Wir halten dies nicht für eine wesentliche Einschränkung, da jede Eizelle als eigene Basiskontrolle für den Vergleich mit Eigenschaften nach Zugabe von Extrakt oder Verbindung fungiert und unserer Erfahrung nach Spannungsverschiebungen, die auf ein bestimmtes kleines Molekül und eine bestimmte Kanalisoform zurückzuführen sind, trotz geringfügiger Änderungen ähnlich sind in der Startmittelpunkt-Spannungsabhängigkeit.

Carnosinsäure eröffnet neue experimentelle und potenzielle therapeutische Möglichkeiten aufgrund seiner einzigartigen Kombination aus hoher Wirksamkeit und Isoformenselektivität, kombiniert mit einer Wirksamkeit im niedrigen mikromolaren Bereich, die es für beide Anwendungsarten in den nützlichen Bereich bringt. Aus experimenteller Sicht sollte sich ein kleines Molekül, das problemlos zwischen KCNQ3/5 und KCNQ2/3 unterscheiden kann, bei der Beschreibung der Rolle beider Komplexe in neuronalen und anderen Zelltypen als unschätzbar wertvoll erweisen, und mit der richtigen Dosierung und dem richtigen Spannungsprotokoll könnte dies sogar der Fall sein verwenden Carnosinsäure, um KCNQ3/5 von KCNQ2/5 und KCNQ2/3/5 zu unterscheiden, wobei die beiden letztgenannten Komplexe erst kürzlich im Gehirn von Mäusen entdeckt wurden4. Während Carnosinsäure auch heteromere KCNQ2/5- und KCNQ2/3/5-Kanäle öffnet, von denen angenommen wird, dass sie sich auch in Neuronen bilden4, ist Carnosinsäure gegenüber den anderen bekannten Kanälen zu 100 % selektiv für KCNQ3/5, wenn man die Zelle auf −120 mV hält neuronale Heteromere (Abb. 7). Aus therapeutischer Sicht könnte es, da die verschiedenen Rollen der neuronalen KCNQ-Heteromere herausgearbeitet werden, klinische Möglichkeiten für einen KCNQ3/5-selektiven Öffner geben, die wir noch nicht verstehen – möglicherweise aufgrund der alten Verwendung von Rosmarin als Kräutermedizin. Unsere Ergebnisse unterstreichen das enorme Potenzial von Pflanzen, weiterhin kleine Moleküle mit neuartigen Aktivitäten zu liefern, und damit einhergehend die dringende Notwendigkeit, traditionelle botanische Medizinpraktiken und die natürlichen Umgebungen, die sie unterstützen, anzuerkennen, von ihnen zu lernen und sie zu bewahren.

Salvia rosmarinus-Proben (Blüten, Blätter und ganze oberirdische Teile) wurden von seinen Kindern im Garten des entsprechenden Autors gesammelt und dann bis zum Tag der Entnahme eingefroren. Wir homogenisierten die Proben mithilfe einer Perlenmühle mit Porzellanperlen in Chargen in 50-ml-Röhrchen (Omni International, Kennesaw, GA, USA). Wir suspendierten die Homogenate in 80 % Methanol/20 % Wasser (100 ml pro 5 g Feststoff) und inkubierten sie dann 48 Stunden lang bei Raumtemperatur, wobei wir die Flaschen gelegentlich umdrehten, um die Extrakte zu resuspendieren. Als nächstes haben wir die Extrakte durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 (Whatman, Maidstone, UK) gefiltert und dann das Methanol durch Verdampfen in einem Abzug für 24–48 Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Wir haben die Extrakte 10 Minuten lang bei 15 °C und 4000 RCF zentrifugiert, um die restlichen Partikel zu entfernen, und anschließend bei –20 °C gelagert. Am Tag der elektrophysiologischen Aufnahme haben wir die Extrakte aufgetaut und unmittelbar vor der Verwendung 1:100 in Badlösung (siehe unten) verdünnt.

Wir generierten cRNA-Transkripte, die für menschliches KCNQ1, 2, 3 und 5 (Wildtyp und Mutant) kodieren, durch In-vitro-Transkription unter Verwendung des mMessage mMachine-Kits (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers nach Vektorlinearisierung. aus cDNA, die in Expressionsvektoren (pTLNx und pXOOM) subkloniert wurde und Xenopus laevis-β-Globin-5'- und 3'-UTRs enthält, die die kodierende Region flankieren, um die Translation und die cRNA-Stabilität zu verbessern. Mutierte KCNQ-cDNAs wurden von Genscript (Piscataway, NJ, USA) erzeugt und cRNAs wie oben hergestellt. Wir injizierten defollikulierten Xenopus laevis-Eizellen der Stadien V und VI (Xenoozyten, Dexter, MI, USA) KCNQ-cRNAs (2–10 ng) und inkubierten die Eizellen bei 16 °C in ND96-Eizellen-Aufbewahrungslösung, die Penicillin und Streptomycin enthielt, mit täglichem Waschen, z 2–4 Tage vor der TEVC-Aufzeichnung (Two-Electrode-Voltage-Clamp).

Wir führten TEVC bei Raumtemperatur mit einem OC-725C-Verstärker (Warner Instruments, Hamden, CT, USA) und der pClamp10-Software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 2–4 Tage nach der cRNA-Injektion durch. Wir legten Eizellen in ein kleinvolumiges Eizellenbad (Warner) und betrachteten sie mit einem Dissektionsmikroskop zur zellulären Elektrophysiologie. Wir haben Chemikalien von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) und Combi-Blocks (San Diego, CA, USA) bezogen. Wir untersuchten die Wirkung von Salvia rosmarinus-Extrakten und von Verbindungen, die direkt in der Badlösung gelöst wurden (in mM): 96 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES (pH 7,6). Vor der Aufzeichnung haben wir 3 Minuten lang Extrakte oder Verbindungen durch Schwerkraftperfusion mit einem konstanten Fluss von 1 ml pro Minute in das Oozyten-Aufzeichnungsbad eingebracht. Pipetten hatten einen Widerstand von 1–2 MΩ, wenn sie mit 3 M KCl gefüllt waren. Wir haben Ströme als Reaktion auf Spannungsimpulse zwischen –120 mV und +40 mV in 10-mV-Intervallen ab einem Haltepotential von –80 mV aufgezeichnet, um Strom-Spannungs-Beziehungen zu ermitteln und die Aktivierungskinetik zu untersuchen. Wir analysierten die Daten mit der Software Clampfit (Molecular Devices) und Graphpad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA) und gaben die Werte als Mittelwert ± SEM an. Wir haben rohe oder normalisierte Schwanzströme gegen die Vorimpulsspannung aufgetragen und mit einer einzigen Boltzmann-Funktion angepasst:

Dabei ist g der normalisierte Schwanzleitwert, A1 der Anfangswert bei -∞, A2 der Endwert bei +∞, V1/2 die halbmaximale Aktivierungsspannung und Vs der Steigungsfaktor. Wir haben die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik mit einzelnen Exponentialfunktionen angepasst.

Carnosinsäure wurde von Combi-Blocks (San Diego, CA) oder Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Pisiferinsäure wurde von Combi-Blocks bezogen. Carnosol war im Handel von Sigma-Aldrich erhältlich oder wurde aus Carnosolsäure nach der Methode von Han et al.48 hergestellt. Carnosinsäurediacetat, Methylcarnosat und Carnosinsäure-γ-lacton wurden nach der Methode von Han et al.48 hergestellt. Konz. Salzsäure (35–38 % in Wasser) stammte von Fisher. Methanol (MeOH), Ethylacetat (EtOAc), Toluol, Dichlormethan (CH2Cl2) und Hexane waren HPLC- oder LC/MS-Qualität von Fisher oder VWR International. Wasserfreies Aceton wurde von Sigma-Aldrich geliefert. Das Wasser war 18,2 mΩ-cm und stammte aus einem Barnstead NANOpure DiamondTM-System. Trifluoressigsäure wurde von EMD Millipore bezogen. Die Schmelzpunkte (Fp.) wurden mit einem elektrothermischen MEL-TEMP 3.0-Gerät (Barnstead International, Dubuque, IA) bestimmt und sind nicht korrigiert.

Präparative HPLC-Trennungen wurden mit einem Shimadzu-System durchgeführt, das aus zwei LC-8A-Pumpen, einem Fraktionssammler (FRC-10A), einem SIL-10AP-Autosampler, einem Diodenarray-Detektor (CPD-M20A) und einem CBM-20A-Kommunikationsmodul bestand . Für die Trennungen wurde eine Waters PREP Nova-Pak® HR C18 6 µM 60 Å 40 × 100 mm Umkehrphasensäule mit einem 40 × 10 mm Guard-Pak-Einsatz und einer Waters PrepLC Universal Base verwendet. Das verwendete Lösungsmittelsystem bestand aus MeOH/Wasser-Gradienten, die beide 0,1 % TFA enthielten. Die Fraktionen wurden basierend auf ihrer Reaktion bei 254 nm gesammelt. Die Flash-Chromatographie wurde auf 230–400 Mesh Kieselgel (Silicagel 60, Geduran) durchgeführt, das von Fisher Scientific erhalten wurde, unter Verwendung der Methode von Still et al.49. Die Säulen wurden mit EtOAc/Hexan-Mischungen oder CH2Cl2 eluiert. Für die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurden Analtech GHLF UV254 UniplateTM-Kieselgelplatten von Miles Scientific verwendet. Die Platten wurden unter UV-Licht oder mit I2-Dampf sichtbar gemacht.

Für die Massenspektroskopie wurde ein dreistufiges Quadrupol-Massenspektrometer Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra eingesetzt. Abhängig von der Struktur des Analyten wurde die beheizte Elektrospray-Ionisation (H-ESI) im negativen oder positiven Ionisationsmodus verwendet. Zur Maximierung der Empfindlichkeit wurden automatische Methoden zur Optimierung der Geräteparameter eingesetzt. Die Proben wurden durch direkte Injektion in MeOH oder MeOH/Wasser (TFA-Konzentration bei 0,01 % oder weniger gehalten) unter Verwendung einer Spritzenpumpe analysiert.

Für die Synthese von Carnosinsäurediacetat wurde Carnosinsäure (1,02 g, 3,05 mmol) in CH2Cl2 (13 ml) mit reinem Essigsäureanhydrid (1,6 ml) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 443 mg) behandelt. Nach Zugabe des DMAP wurde die Reaktion erwärmt. Die resultierende gelbe Lösung wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde dann mit CHCl3 (40 ml) verdünnt und mit 1 M wässriger Lösung extrahiert. HCl-Lösung (25 ml). Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und zur Trockne eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie mit einem Gradienten von 4:1 bis 3:1 Hexan/EtOAc gereinigt. Das Produkt wurde als Öl (480 mg) isoliert, das sich beim Stehen verfestigte. Der resultierende Feststoff hatte einen Schmelzpunkt von 94–95 °C (Schmelzpunkt 158–159 °C50). MS ESI− m/z 415 (M – H+).

Für die Methylcarnosat-Synthese wurde Carnosinsäure (329 mg, 0,99 mmol) in 5:1 Toluol/MeOH (6 ml) unter N2 gelöst und in einem Eiswasserbad gekühlt. Die Reaktion wurde mit einer 1,8 bis 2,4 M Lösung von TMSCN2 in Hexanen (Thermo-Fisher; 1,1 ml) behandelt, die tropfenweise über eine Spritze zugegeben wurde. Die Reaktion wurde kalt gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde in einem Eiswasserbad und einer 2 M wässrigen Lösung abgekühlt. HOAc-Lösung wurde hinzugefügt (10 ml). Die Zweiphasenmischung wurde zwischen Wasser und EtOAc verteilt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und konzentriert. im Vakuum. Flash-Chromatographie mit 9:1 Hexanen/EtOAc ergab 191 mg des Methylesters als weißen Feststoff mit einem Schmelzpunkt, der bei 118 °C erweicht und bei 126–127 °C schmilzt (beleuchteter Schmelzpunkt 118–119 °C51). MS ESI – m/z 345 (M – H+).

Für die Carnosinsäure-γ-Lacton-Synthese wurde Carnosinsäure (125 mg, 0,30 mmol) in 3 ml CH2Cl2 mit festem DCC (86 mg) behandelt. Fast sofort bildete sich ein ppt. Anschließend wurde verkauftes DMAP (7,7 mg) zugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden lang bei Raumtemperatur unter N2 gerührt und dann filtriert. Die Mutterlauge wurde zur Trockne konzentriert und durch Flash-Chromatographie (100 % CH2Cl2) gereinigt. Das Lacton (40 mg) wurde als gelber Schaum isoliert. Der Schmelzpunkt des Lactons liegt bei 106–109 °C52. MS ESI− m/z 313 (M – H+).

Der Dimethylether von Carnosol wurde nach der Methode von Luis et al. hergestellt. (Luis, JG et al.53. mit der Ausnahme, dass die Verbindung durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt wurde.

Für die Di-d3-methylcarnosol-Synthese wurde Carnosol (100 mg, 0,30 mmol) in Aceton (16 ml) in einem Eiswasserbad mit reinem d3-MeI (500 µL, 1,16 g, 8,00 mmol) und 2 Äq. K2CO3 (84 mg, 0,60 mmol). Die resultierende Mischung wurde kalt gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde mit kaltem Wasser verdünnt und mit EtOAc (3 × 40 ml) extrahiert. Die gesammelte organische Schicht (gelb) wird mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und zur Trockne eingeengt, Taragewicht 130,835 g, Gewicht 138 mg. Das Rohprodukt wurde durch RPHPLC (20 bis 100 % MeOH/Wasser mit 0,1 % TFA) gereinigt. Fraktionen mit RT 6,6 min wurden gesammelt und auf 13 mg Di-d3-methylcarnosol als Öl konzentriert; Brennpunkt 155–157 °C50. MS (ESI+) m/z 365 (M + H+) und 387 (M + Na+).

Wir haben chemische Strukturen und das elektrostatische Oberflächenpotential mit Jmol, einem Open-Source-Java-Viewer für chemische Strukturen in 3D, aufgezeichnet und betrachtet: http://jmol.org/. Für In-silico-Ligand-Docking-Vorhersagen der Interaktion mit KCNQ-Kanälen führten wir ungesteuertes Docking durch, um potenzielle Interaktionsstellen vorherzusagen, indem wir SwissDock mit CHARMM-Kraftfeldern54,55, der aus Kryo-EM abgeleiteten KCNQ2-Struktur (PDB: 7CR0)27 und dem AlphaFold28,29- verwendeten. vorhergesagte KCNQ3-Modellstruktur (Supplementary Structure File 1) und die neuronale KCNQ (KCNQ5)-Modellstruktur (Supplementary Structure File 2)15.

Alle Werte werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Mehrere Vergleichsstatistiken wurden unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit einem Post-hoc-Tukey-HSD durchgeführt. Der Vergleich zweier Gruppen wurde mithilfe eines t-Tests durchgeführt; alle p-Werte waren zweiseitig. Elektrophysiologische Daten wurden in mindestens zwei Eizellenchargen bestätigt. Biologische Replikate werden als Anzahl der Eizellen definiert; Die Stichprobengrößen sind in den Legenden der Abbildungen angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten für Abb. 1–10 sind im Dryad-Datenrepository verfügbar: https://doi.org/10.7280/D1GH5Q.

Abbott, GW KCNQs: Liganden- und spannungsgesteuerte Kaliumkanäle. Vorderseite. Physiol. 11, 583 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Abbott, GW Biologie des KCNQ1-Kaliumkanals. Neue J. Sci. 2014, 26 (2014).

Artikel Google Scholar

Bal, M., Zaika, O., Martin, P. & Shapiro, MS Calmodulin-Bindung an K+-Kanäle vom M-Typ, getestet durch TIRF/FRET in lebenden Zellen. J. Physiol. 586, 2307–2320 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soh, H., Springer, K., Doci, K., Balsbaugh, JL & Tzingounis, AV KCNQ2 und KCNQ5 bilden heteromere Kanäle unabhängig von KCNQ3. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 119, e2117640119 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, HS et al. KCNQ2- und KCNQ3-Kaliumkanal-Untereinheiten: molekulare Korrelate des M-Kanals. Science 282, 1890–1893 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Abbott, GW KCNE2 und der K (+)-Kanal: Der Schwanz wedelt mit dem Hund. Kanäle (Austin) 6, 1–10 (2012).

Abbott, GW & Jepps, TA Kcne4-Deletion verändert geschlechtsabhängig die Gefäßreaktivität. J. Vasc. Res. 53, 138–148 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lehman, A. et al. Funktionsverlust- und Funktionsgewinnmutationen in KCNQ5 führen zu geistiger Behinderung oder epileptischer Enzephalopathie. Bin. J. Hum. Genet. 101, 65–74 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schroeder, BC, Kubisch, C., Stein, V. & Jentsch, TJ Ein mäßiger Funktionsverlust der zyklisch-AMP-modulierten KCNQ2/KCNQ3-K+-Kanäle verursacht Epilepsie. Nature 396, 687–690 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Singh, NA et al. KCNQ2- und KCNQ3-Kaliumkanalgene bei gutartigen familiären neonatalen Krämpfen: Erweiterung des Funktions- und Mutationsspektrums. Brain 126, 2726–2737 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

De Silva, AM, Manville, RW & Abbott, GW Die Dekonstruktion einer afrikanischen Volksmedizin deckt eine neuartige molekulare Strategie für die therapeutische Aktivierung von Kaliumkanälen auf. Wissenschaft. Adv. 4, eaav0824 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Manville, RW & Abbott, GW Alte und moderne Antikonvulsiva wirken synergistisch in einer KCNQ-Kaliumkanal-Bindungstasche. Nat. Komm. 9, 3845 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Manville, RW & Abbott, GW Korianderblätter enthalten ein starkes, den Kaliumkanal aktivierendes Antikonvulsivum. FASEB J. 33, 11349–11363 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Manville, RW et al. Die Aktivierung von KCNQ5 durch Tannine vermittelt die gefäßrelaxierende Wirkung von Rinden, die in der botanischen Medizin der amerikanischen Ureinwohner verwendet werden. FASEB J. 36, e22457 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Manville, RW et al. Die KCNQ5-Aktivierung ist ein einheitlicher molekularer Mechanismus, der genetisch und kulturell unterschiedlichen pflanzlichen blutdrucksenkenden Volksmedikamenten gemeinsam ist. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 116, 21236–21245 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Redford, KE & Abbott, GW Das allgegenwärtige Flavonoid Quercetin ist ein atypischer KCNQ-Kaliumkanalaktivator. Komm. Biol. 3, 356 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Paine, A. Heilpflanzen der keltischen Druiden: Die alten Kelten in Großbritannien und ihre druidischen Heiler verwendeten Pflanzenmedizin zur Behandlung von Geist, Körper und Seele. (Moon Books, 2018).

Etxeberria, A., Santana-Castro, I., Regalado, MP, Aivar, P. & Villarroel, A. Drei Mechanismen liegen der heteromeren Kalium-M-Kanal-Potenzierung durch KCNQ2/3 zugrunde. J. Neurosci. 24, 9146–9152 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schroeder, BC, Hechenberger, M., Weinreich, F., Kubisch, C. & Jentsch, TJ KCNQ5, ein neuartiger Kaliumkanal, der im Gehirn weit verbreitet ist, vermittelt M-Typ-Ströme. J. Biol. Chem. Rev. 275, 24089–24095 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wickenden, AD, Zou, A., Waggoner, PK & Jegla, T. Charakterisierung von KCNQ5/Q3-Kaliumkanälen, die in Säugetierzellen exprimiert werden. Br. J. Pharmacol. Rev. 132, 381–384 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharma, Y., Velamuri, R., Fagan, J. & Schaefer, J. Vollspektrumanalyse bioaktiver Verbindungen in Rosmarin (Rosmarinus officinalis L.), beeinflusst durch verschiedene Extraktionsmethoden. Moleküle 25, https://doi.org/10.3390/molecules25204599 (2020).

Kim, RY, Pless, SA & Kurata, HT PIP2 vermittelt die funktionelle Kopplung und Pharmakologie neuronaler KCNQ-Kanäle. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 114, E9702–E9711 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaydman, MA & Cui, J. PIP2-Regulation von KCNQ-Kanälen: biophysikalische und molekulare Mechanismen für die Lipidmodulation des spannungsabhängigen Gatings. Vorderseite. Physiol. 5, 195 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Murata, Y., Iwasaki, H., Sasaki, M., Inaba, K. & Okamura, Y. Phosphoinositid-Phosphatase-Aktivität gekoppelt an einen intrinsischen Spannungssensor. Natur 435, 1239–1243 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hossain, MI et al. Die Enzymdomäne beeinflusst die Bewegung des Spannungssensors in spannungsempfindlichen Phosphatasen von Ascidian und Zebrafischen. J. Biol. Chem. 283, 18248–18259 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Manville, RW, Papanikolaou, M. & Abbott, GW Direkte Neurotransmitteraktivierung spannungsgesteuerter Kaliumkanäle. Nat. Komm. 9, 1847 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, X. et al. Molekulare Grundlage für die Ligandenaktivierung des menschlichen KCNQ2-Kanals. Zellauflösung 31, 52–61 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jumper, J. et al. Hochpräzise Vorhersage der Proteinstruktur mit AlphaFold. Natur 596, 583–589 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Varadi, M. et al. AlphaFold-Proteinstrukturdatenbank: Erweitert die strukturelle Abdeckung des Proteinsequenzraums massiv mit hochpräzisen Modellen. Nukleinsäuren Res. 50, D439–D444 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lange, W. et al. Verfeinerung der Bindungsstelle und Wirkungsweise des Antikonvulsivums Retigabin auf KCNQ-K+-Kanälen. Mol. Pharmakol. 75, 272–280 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wuttke, TV, Seebohm, G., Bail, S., Maljevic, S. & Lerche, H. Das neue Antikonvulsivum Retigabin begünstigt die spannungsabhängige Öffnung des Kv7.2 (KCNQ2)-Kanals durch Bindung an sein Aktivierungstor. Mol. Pharmakol. 67, 1009–1017 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, AW, Yang, R. & Kurata, HT Sequenzdeterminanten subtypspezifischer Aktionen von KCNQ-Kanalöffnern. J. Physiol. 595, 663–676 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bostock, J. & Riley, HT Die Naturgeschichte. Plinius der Ältere. (Taylor & Francis, 1855).

Ghasemzadeh Rahbardar, M. & Hosseinzadeh, H. Therapeutische Wirkung von Rosmarin (Rosmarinus officinalis L.) und seinen aktiven Bestandteilen bei Störungen des Nervensystems. Iran J. Basic Med. Wissenschaft. 23, 1100–1112 (2020).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Solhi, H. et al. Wohltuende Wirkung von Rosmarinus officinalis zur Behandlung des Opiumentzugssyndroms während Suchtbehandlungsprogrammen: eine klinische Studie. Süchtig. Gesundheit 5, 90–94 (2013).

PubMed PubMed Central Google Scholar

El Alaoui, C., Chemin, J., Fechtali, T. & Lory, P. Modulation von T-Typ-Ca2+-Kanälen durch Lavendel- und Rosmarinextrakte. PLoS One 12, e0186864 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rutherford, DM et al. Isolierung und Identifizierung von zwei Diterpenen aus Salvia officinalis, die die Bindung von t-Butylbicyclophosphoro[35S]thionat an den Chloridkanal der zerebrokortikalen Membranen von Ratten in vitro hemmen. Neurosci Lett. 135, 224–226 (1992).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, QL et al. Akute und 30-tägige orale Toxizitätsstudien von verabreichter Carnosinsäure. Lebensmittelchem. Toxicol. 50, 4348–4355 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schenzer, A. et al. Molekulare Determinanten der K+-Kanal-Empfindlichkeit von KCNQ (Kv7) gegenüber dem Antikonvulsivum Retigabin. J. Neurosci. 25, 5051–5060 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De la Rosa, V., Guzman-Hernandez, ML und Carrillo, E. Triclosan ist ein KCNQ3-Kaliumkanalaktivator. Pflugers Arch. 474, 721–732 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Lin, D., Zhou, Q., Xie, X. & Liu, Y. Mögliche biochemische und genetische Toxizität von Triclosan als neu auftretender Schadstoff bei Regenwürmern (Eisenia fetida). Chemosphere 81, 1328–1333 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rezaie, T. et al. Schutzwirkung von Carnosinsäure, einer proelektrophilen Verbindung, in Modellen für oxidativen Stress und lichtinduzierte Netzhautdegeneration. Investieren. Ophthalmol. Vis. Wissenschaft. 53, 7847–7854 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Bin. J. Physiol. Zellphysiologie 301, C1017–C1026 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suh, BC & Hille, B. PIP2 ist ein notwendiger Cofaktor für die Ionenkanalfunktion: Wie und warum? Annu. Rev. Biophys. 37, 175–195 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Y. et al. Ein PIP(2)-Ersatz vermittelt die Spannungssensor-Poren-Kopplung bei der KCNQ-Aktivierung. Komm. Biol. 3, 385 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, AW et al. Für die maximale Wirkung eines auf einen Spannungssensor ausgerichteten KCNQ-Öffners sind vier arzneimittelempfindliche Untereinheiten erforderlich. J. Gen. Physiol. 150, 1432–1443 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lerche, C. et al. Molekulare Klonierung und funktionelle Expression von KCNQ5, einer Kaliumkanal-Untereinheit, die zur neuronalen M-Strom-Diversität beitragen könnte. J. Biol. Chem. 275, 22395–22400 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Han, S. et al. Farnesylpyrophosphat-Synthase als Ziel für die Arzneimittelentwicklung: Entdeckung von aus Naturstoffen gewonnenen Inhibitoren und ihrer Aktivität in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen. J. Med. Chem. 62, 10867–10896 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Still, WC, Kahn, M. & Mitra, A. Schnelle chromatographische Technik für präparative Trennungen mit mäßiger Auflösung. J. Org. Chem. 43, 2923–2925 (1978).

Artikel CAS Google Scholar

Macias-Alonso, M. et al. Hemmung der Squalensynthase der Rattenleber durch Abietan-Diterpen-Derivate. Nat. Prod. Res. 35, 2972–2976 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cao, W. et al. Effiziente Synthese von Icetexan-Diterpenen und Apoptose-induzierende Wirkung durch Hochregulierung der BiP-ATF4-CHOP-Achse in kolorektalen Zellen. J. Nat. Prod. 84, 2012–2019 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pertino, MW et al. Gastroprotektive Wirkung von Carnosinsäure-Gamma-Lacton-Derivaten. J. Nat. Prod. 73, 639–643 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Luis, JG, Andrés, LS, Fletcher, WQ, Lahlou, EH & Perales, A. Umlagerung von Methyl-11,12-di-O-methyl-6,7-didehydrocarnosat in basischem Medium. Einfache Hemisynthese von Miltiron. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 2207–2211 (1996).

Grosdidier, A., Zoete, V. & Michielin, O. SwissDock, ein Webdienst zum Andocken von Proteinen und kleinen Molekülen basierend auf EADock DSS. Nukleinsäuren Res. 39, W270–W277 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grosdidier, A., Zoete, V. & Michielin, O. Schnelles Andocken mit dem CHARMM-Kraftfeld mit EADock DSS. J. Comput. Chem. 32, 2149–2159 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sun, J. & MacKinnon, R. Strukturelle Grundlagen der menschlichen KCNQ1-Modulation und -Gating. Zelle 180, 340–347.e349 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zheng, Y. et al. Strukturelle Einblicke in die Lipid- und Ligandenregulation eines menschlichen neuronalen KCNQ-Kanals. Neuron 110, 237–247.e234 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde von den National Institutes of Health, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS107671) an GWA und einem Susan Samueli Integrative Health Institute, Samueli-Stipendium an GWA unterstützt. Wir danken Dr. Ryan Yoshimura für technische Unterstützung und Beratung, George Abbott und Victoria Abbott für die Sammlung von Salvia rosmarinus-Proben und Bo Abbott für Salvia rosmarinus-Bilder.

Bioelektrizitätslabor, Abteilung für Physiologie und Biophysik, School of Medicine, University of California, Irvine, CA, USA

Rían W. Manville, Derk Hogenkamp und Geoffrey W. Abbott

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

GWA und RWM haben die Studie konzipiert; RWM führte eine TEVC-Analyse durch und analysierte Daten; DH konzipierte, synthetisierte und analysierte Chemikalien, GWA beaufsichtigte und erhielt die Finanzierung für das Projekt; RWM, DH und GWA haben die Zahlen vorbereitet, GWA hat das Manuskript geschrieben; Alle Autoren haben das Manuskript bearbeitet.

Korrespondenz mit Geoffrey W. Abbott.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Jerome Lacroix und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Yun Luo und Joao Valente. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Manville, RW, Hogenkamp, ​​D. & Abbott, GW Die alte Heilpflanze Rosmarin enthält einen hochwirksamen und Isoform-selektiven KCNQ-Kaliumkanalöffner. Commun Biol 6, 644 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05021-8

Zitat herunterladen

Eingegangen: 17. Januar 2023

Angenommen: 06. Juni 2023

Veröffentlicht: 15. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05021-8

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.